赭曲霉毒素A對IPEC-J2細(xì)胞Nrf2抗氧化系統(tǒng)的影響及硒的保護(hù)效應(yīng)研究.pdf

1、本研究旨在考察赭曲霉毒素A(OTA)對仔豬空腸上皮細(xì)胞IPEC-J2的毒害效應(yīng)及抗氧化劑硒（亞硒酸鈉來源）是否對OTA暴露下的細(xì)胞具有保護(hù)作用。研究共包括兩個試驗。
　　 試驗一 OTA對IPEC-J2細(xì)胞的生長及Nrf2介導(dǎo)的抗氧化系統(tǒng)的影響
　　 本試驗在研究OTA暴露濃度和暴露時間對IPEC-J2細(xì)胞存活影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了OTA對細(xì)胞氧化還原平衡的影響及機(jī)理。
　　 首先，采用3×9因子設(shè)計，考察0

2、、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1、1.5、2μM/L的OTA處理IPEC-J2細(xì)胞12h、24h和48h，對細(xì)胞存活率的影響，每個處理6個重復(fù)。結(jié)果表明，OTA以時間-劑量依賴方式降低IPEC-J2細(xì)胞存活率，OTA濃度和處理時間均對細(xì)胞存活率產(chǎn)生極顯著影響(P＜0.01)，且二者間存在極顯著交互效應(yīng)(P＜0.01)。
　　 在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，選用0、0.1、0.5和1μM/L的OTA與細(xì)胞共培養(yǎng)24h，考察OT

3、A對IPEC-J2細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能完整性和氧化還原狀態(tài)相關(guān)指標(biāo)的影響，并初步探討OTA對IPEC-J2細(xì)胞Nrf2活性的影響。研究結(jié)果顯示：
　　 1、培養(yǎng)液LDH活性隨OTA濃度增加呈線性或二次曲線增加(P＜o(jì).01)，細(xì)胞Na+-K+-ATPase活性則呈線性或二次曲線降低(P＜0.01);
　　 2、細(xì)胞T-AOC和GSH含量、GPx、GST和GR酶活性均隨OTA濃度增加而呈極顯著的線性或二次曲線降低(P＜0.01)，

4、培養(yǎng)液中MDA含量則呈極顯著的線性或二次曲線增加(P＜0.01);OTA暴露對細(xì)胞SOD和CAT活性無顯著影響；
　　 3、GSTA2、GSTO1、TrxR1、GR、GCLC和GCLM的mRNA相對表達(dá)量隨OTA濃度增加呈極顯著的線性或二次曲線降低(P＜0.01),OTA對GPx2mRNA的表達(dá)無顯著影響；
　　 4、隨OTA濃度的增加，Nrf2活性呈先增加然后逐漸降低變化。
　　 上述結(jié)果表明，OTA以時間-劑

5、量依賴方式對IPEC-J2細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，Nrf2介導(dǎo)的抗氧化防御系統(tǒng)的抑制是OTA毒性效應(yīng)可能的機(jī)制。
　　 試驗二硒（亞硒酸鈉源）對OTA暴露下IPEC-J2細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)
　　 試驗研究了硒（亞硒酸鈉源）對OTA誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)效應(yīng)，并進(jìn)一步探討了硒是否能激活Nrf2系統(tǒng)而發(fā)揮抗氧化作用。
　　 試驗首先采用MTT法考察了OTA染毒和不染毒情況下，硒對IPEC-J2細(xì)胞存活和增殖的影

6、響。結(jié)果表明，硒可以提高OTA暴露下的細(xì)胞存活率。
　　 然后考察了硒能否提高OTA染毒條件下細(xì)胞的抗氧化防御能力。試驗共設(shè)4個處理，即先用0、4、8μM/L硒分別預(yù)處理細(xì)胞12h，再與OTA（1μM/L）共培養(yǎng)24h,分別表示為PBS/OTA組、SS4/OTA組、SS8/OTA組，其中PBS/OTA組為負(fù)對照組，同時另設(shè)一個未用OTA暴露的正對照組，即PBS/乙醇組?？疾熘笜?biāo)包括細(xì)胞培養(yǎng)液LDH活性、細(xì)胞Na+-K+-ATPa

7、se活性、細(xì)胞氧化還原狀態(tài)以及抗氧化系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)，并進(jìn)一步檢測抗氧化酶的mRNA表達(dá)水平。研究結(jié)果顯示：
　　 1、與負(fù)對照組相比，硒預(yù)處理可顯著降低OTA暴露細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的活性(P＜o(jì).05)，提高細(xì)胞Na+-K+-ATPase活性(P＜o(jì).05)；且8μM/L硒預(yù)處理對細(xì)胞的保護(hù)效果優(yōu)于4μM/L硒預(yù)處理組；
　　 2、硒預(yù)處理能提高IPEC-J2細(xì)胞T-AOC，在8μM/L時達(dá)到顯著水平(P＜0.05);與負(fù)

8、對照組相比，硒預(yù)處理（SS4/OTA和SS8/OTA組）降低了MDA的含量，顯著提高OTA暴露下細(xì)胞的GPx、GST、GR活性(P＜0.05)，對SOD活性有提高的趨勢，但是GSH含量顯著低于正和負(fù)對照組(P＜0.05);
　　 3、與負(fù)對照組相比，隨培養(yǎng)基中硒濃度的提高(0、4、8μM/L),GCLC、GLCM、GPx2、GSTO1、GSTA2、TrxR1、GR的mRNA相對表達(dá)量均呈遞增趨勢，GCLC和TrxR1的mRNA表

9、達(dá)水平甚至接近或超過正對照組。
　　 在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用2×3因子設(shè)計，研究細(xì)胞經(jīng)0、4、8μM/L硒（亞硒酸鈉源）預(yù)處理12h后，替換含OTA(0、1μM)培養(yǎng)液攻毒培養(yǎng)24h對Nrf2的活化影響。結(jié)果表明，添加硒對緩解OTA導(dǎo)致的Nrf2活化抑制。
　　 綜上所述，本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)OTA破壞了IPEC-J2細(xì)胞的氧化還原平衡，抑制Nrf2的活化從而抑制下游抗氧化基因的表達(dá)是毒性效應(yīng)的可能機(jī)制。添加硒可以通過促進(jìn)N