乙型肝炎病毒介導載脂蛋白和NQO1對肝細胞脂肪化的作用及機制研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)導致急慢性乙型肝炎,并與肝硬化和肝細胞癌(Hepatocelluar carcinoma,HCC)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來由于脂肪性肝病(Fatty liver disease,FLD)的發(fā)病率逐年增加,導致脂肪肝與慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)合并存在的病例明顯增多,對兩者相關(guān)性的研究逐漸受到重視。但是迄今為止,HBV與脂肪肝的關(guān)系尚未完全闡明

2、。本課題組先前通過蛋白質(zhì)組學和MALDI-TOF/TOFMS技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)HBV影響肝細胞載脂蛋白(Apolipoprotein,Apo)的表達,并降低NAD(P)H醌氧化還原酶1(NAD(P)H dehydrogenase:quinone 1,NQO1)的表達,現(xiàn)有研究表明上述因子參與脂肪酸的合成和代謝,對肝臟脂質(zhì)代謝動態(tài)循環(huán)平衡的維持起著重要的作用。本研究在此基礎(chǔ)上,探討HBV編碼蛋白(LHBs、MHBs、HBs、HBc、HBe、HB

3、pol、HBx)與特定宿主細胞中載脂蛋白表達的對應關(guān)系,進一步探討HBV影響NQO1致肝細胞脂肪化的機制,有助于更深入了解HBV的致病機制,為有效地進行脂肪肝的防治提供理論基礎(chǔ)。
　　本研究第一部分旨在探討HBV整體水平對Apo基因的影響。通過對HBV細胞株和pRep-HBV質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染細胞中HBsAg及HBeAg的檢測,確定HBV基因組的正常復制和表達;通過realtime RT-PCR的方法,檢測了16種Apo基因在HepG2

4、.2.15及HepG2細胞中表達的差異,并進一步用瞬時轉(zhuǎn)染的方法在Huh7、HepG2和Hep3B細胞進行驗證,結(jié)果表明ApoAI,ApoAII,ApoAV,ApoB,ApoCIII,ApoE,ApoF,ApoH,ApoJ,ApoL1和ApoM和對照組相比轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低,APOD的轉(zhuǎn)錄水平和對照組相比明顯升高;通過檢測不同時間點HBV表達量對上述Apo基因轉(zhuǎn)錄水平的影響,證實HBV表達量對Apo基因的表達影響具有時間效應。
　

5、　本研究第二部分應用Ad Easy XL System構(gòu)建HBV七種編碼蛋白的重組腺病毒表達載體Ad-LHBs、Ad-MHBs、Ad-HBs、Ad-HBc、Ad-HBe、Ad-HBpol、Ad-HBx及對照空病毒Ad-GFP,探討HBV編碼蛋白對特定宿主細胞中Apo基因表達的對應關(guān)系。通過對腺病毒包裝過程的監(jiān)測和Western blot檢測,成功構(gòu)建可分別表達HBVLS、MS、S、Core、E、Pol、X蛋白的重組腺病毒;通過real

6、time RT-PCR檢測HBV七種編碼蛋白對Apo基因的表達影響,我們發(fā)現(xiàn)HBs下調(diào)ApoAII的轉(zhuǎn)錄水平,MHBs下調(diào)ApoF的轉(zhuǎn)錄水平,HBpol下調(diào)ApoH的轉(zhuǎn)錄水平,且均與HBV整體水平結(jié)果一致;通過western blot進一步檢測ApoAII、ApoF和ApoH基因蛋白水平的變化,發(fā)現(xiàn)HBs下調(diào)ApoAII蛋白水平,與轉(zhuǎn)錄水平一致;MHBs和HBpol分別上調(diào)ApoF和ApoH的蛋白水平,與轉(zhuǎn)錄水平不一致,我們考慮可能存在

7、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯和翻譯后水平的多種組合調(diào)控,具體機制有待進一步的研究。
　　本研究第三部分旨在探討HBV特別是HBx抑制NQO1致肝細胞脂肪化的機制。通過對活細胞內(nèi)源性ROS和超氧化物的檢測,證實HBx通過抑制NQO1的表達從而誘發(fā)細胞的氧化應激;通過對細胞內(nèi)抗氧化酶還原性谷胱甘肽GSH的檢測,表明過量的ROS產(chǎn)生可能會破壞細胞內(nèi)的抗氧化防御體系;應用Annexin-V/PI雙染法檢測細胞凋亡的發(fā)生,證實過量的ROS蓄積引起