莽山烙鐵頭蛇粗毒活性分析及蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的:①分析莽山烙鐵頭蛇(Zhaoermia mangshanensis)粗毒的生物學(xué)活性以及對(duì)粗毒中的蛋白質(zhì)(或者多肽)進(jìn)行鑒定和分析。②分離純化具有生物活性的毒素分子。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:①膜片鉗全細(xì)胞記錄模式下檢測(cè)莽山烙鐵頭蛇粗毒對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)細(xì)胞上電壓門控鈉、鉀、鈣離子通道的影響。②利用分子篩、反相高效液相色譜(RP-HPLC)、MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)分離純化粗毒并分析蛇粗毒中的分子量信息(主要分析分子量<

2、10000Da的多肽組分)。⑨利用超濾、雙向凝膠電泳(2-DE)、蛋白質(zhì)點(diǎn)的膠內(nèi)酶解、兩種質(zhì)譜技術(shù)(TOF-Q和HCT)以及通過生物信息學(xué)處理,鑒定并分析蛇粗毒中的蛋白質(zhì)信息。測(cè)定粗毒的三種酶活力(乙酰膽堿酯酶、酪蛋白水解酶、堿性磷酸酶)。
　　 結(jié)果:①膜片鉗實(shí)驗(yàn)表明莽山烙鐵頭蛇粗毒對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上河豚毒素不敏感型(TTX-R)鈉電流有抑制作用,且具有濃度依從性,IC50大于1000mg/L,1000mg/L粗毒可抑制T

3、TX-R型鈉電流49.4％。粗毒對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上河豚毒素敏感型(TTX-S)鈉通道、鉀通道和鈣通道幾乎無作用。②莽山烙鐵頭蛇粗毒多肽部分的分子量集中在1000Da-5000Da之間,且在分離純化毒素時(shí)乙腈濃度升至20％時(shí)開始有毒素組分被洗脫出來,其中分子量為924Da,1232Da,1814Da,3081Da,4082Da的毒素分子在粗毒中含量較高。⑧經(jīng)蛋白質(zhì)組分析,從莽山烙鐵頭蛇粗毒共鑒定到153種蛋白質(zhì),分子量范圍在3474D

4、a到243,128Da之間,處于10kDa-30kDa之間的蛋白質(zhì)居多；等電點(diǎn)分布在4.61～10.46之間,主要集中在5-7和8-10之間；疏水值在-0.883～+0.052之間,90％以上蛋白質(zhì)的疏水值為負(fù)；鑒定到的大部分蛋白是與催化作用有關(guān)的蛋白,測(cè)定的粗毒三種酶活中蛋白水解酶活力較高(76.40U/mg),乙酰膽堿酯酶活力為46.45U/g,堿性磷酸酶活力為3.1836U/g。有9種蛋白質(zhì)可能發(fā)生了磷酸化修飾,其中有7種與催化作