早期接種卡介苗對哮喘小鼠IL-10和VCAM-1表達(dá)影響的研究.pdf

1、研究背景： 在過去的數(shù)十年內(nèi),哮喘在世界范圍內(nèi)發(fā)病人數(shù)有一定的上升,尤其是高收入國家.人類對支氣管哮喘的發(fā)病機理有了更深入的認(rèn)識,哮喘治療手段也日益增多,但哮喘的發(fā)病率和死亡率并沒有明顯下降.相反,在許多國家哮喘的發(fā)病率和死亡率不降反升,成為人類健康的嚴(yán)重威脅. 近年來研究表明,輔助性T細(xì)胞(Th)Th1/Th2功能失衡,Th2活化亢進在哮喘發(fā)病機制中起重要作用.哮喘患者體內(nèi)Th0向Th2分化過度,Th2細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞

2、因子如IL-4、IL-5及工L-13等促進過敏原特異性IgE的合成,介導(dǎo)骨髓嗜酸性粒細(xì)胞分化、成熟及向肺組織趨化,促進氣道黏液分泌和氣道高反應(yīng)性,從而導(dǎo)致哮喘的發(fā)生.卡介苗(BCG)是結(jié)核分支桿菌減毒活疫苗,是一種很強的Th1免疫反應(yīng)刺激劑,能糾正Th1/Th2失衡.目前為止,以動物進行的研究均顯示BCG 接種能明顯抑制OVA致敏和激發(fā)所致的氣道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤,降低氣道高反應(yīng)性以及Th2型細(xì)胞因子的表達(dá). 白介素-10(IL-

3、10)是炎癥抑制因子,由Th2細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等分泌.DC等細(xì)胞分泌的IL-10,誘發(fā)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞-1(Tr1)進一步分泌IL-10,大量的IL-10可抑制Th2細(xì)胞,從而抑制哮喘和過敏性疾病,IL-10對哮喘和過敏性疾病的作用機制仍不明確,IL-10各種研究資料結(jié)果差異很大,哮喘患者BALF和血中的IL-10上升和下降的表達(dá)都有報道.IL-10對IL-1、IL-4、IL-12、TNFα、NF-KB等多種炎癥因子

4、具有抑制作用,從而間接抑制哮喘患者的肺組織EOS炎癥和氣道高反應(yīng)性等,合成IL-10代表機體的保護性調(diào)節(jié). 哮喘患者的肺組織EOS炎癥,是呼吸道變應(yīng)性炎癥的～個重要特征.血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1),作為特異性地介導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞浸潤到肺組織的粘附分子,在哮喘中可能扮演了重要的角色.VCAM-1除了引起EOS的粘附作用,可能還具有共刺激分子作用,參加機體的免疫調(diào)節(jié).VCAM-1是粘附分子的～員,是一類調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞之間相互粘

5、附、相互作用的膜表面糖蛋白,主要表達(dá)在活化內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞上.VCAM-1的基因表達(dá)主要由轉(zhuǎn)錄因子NF-K B控制.各種致炎因子,如IL-1、IL-4、IL-12、TNF α和IFN-γ等誘導(dǎo)VCAM-1的表達(dá).由于IL-10對IL-4、TNF α、NF-K B等多種炎癥因子具有抑制作用,IL-10可能通過廣泛地抑制炎癥因子,間接對VCAM-1等粘附分子起一定的作用. 本次課題設(shè)計,通過觀察IL-10和V

6、CAM-1的表達(dá),探討卡介苗對哮喘治療的作用機制,為哮喘的實驗理論研究提供支持. 研究目的 本研究給予初生幼鼠早期多次小劑量BCG接種,觀察預(yù)防哮喘的長期(25周)效果.在此過程中,通過觀察IL-10、VCAM-1在小鼠支氣管肺泡灌洗液、肺組織中的表達(dá),探討B(tài)CG預(yù)防哮喘的機制. 研究方法 C57BL/6小鼠分為NS/NS(對照組)、NS/OVA組(模型組)和BCG10<'5>/ovA組、BCG10<'5

7、-3>/OVA組.小鼠出生0、7、14天予減毒活疫苗BCG皮內(nèi)注射接種,第5周、第7周2次卵白蛋白(OVA)腹腔注射致敏,25周3次霧化激發(fā)建立哮喘模型.最后一次抗原激發(fā)48h后收集支氣管肺泡灌洗液(BALF),肺組織石蠟包埋和冰凍保存.肺組織HE染色,觀察哮喘模型是否成功.RT-PCR方法測定肺組織VCAM-1和IL-10的mRNA水平,ELISA方法測定BALF的IL-10水平,肺組織石蠟切片免疫組化方法觀察VCAM-1的表達(dá)情況.

8、 研究結(jié)果 1.氣道局部炎癥變化肺組織病理切片HE染色顯示,抗原激發(fā)48h后模型組肺組織EOS和炎癥細(xì)胞浸潤與對照組相比明顯增多(n=6,P<0.05),BCG10<'5>/OVA和BCG10<'5-3>/OVA肺組織EOS和炎癥細(xì)胞浸潤與模型組相比減少(n=6,P<0.05). 2.RT-PCR檢測肺組織IL-10 mRNA和VCAM-1 mRNA的水平模型組、BCG10<'5>/OVA組、BCG10<'5-3

9、>/OVA組的IL-10 mRNA表達(dá)與對照組相比均明顯增加,差異有顯著性(n=6,p<0.05).而VCAM-1 mRNA各組與對照組間比較并無明顯差異(n=6,p>0.05). 3.ELISA檢測BALF中IL-10蛋白表達(dá)的水平BCG10<'5>/OVA組IL-10水平與模型組、OVA+BCG10<'5-3>組相比有顯著升高(n=6,p<0.05),模型組、BCG10<'5-3>/OVA組與對照組相比有下降,但無顯著性差異

10、(n=6,p>0.05). 4.免疫組化檢測肺組織中VCAM-1蛋白表達(dá)的水平肺組織病理切片免疫組化染色顯示,VCAM-1主要表達(dá)于支氣管粘膜氣道上皮、支氣管平滑肌、血管內(nèi)皮、血管周圍淋巴等細(xì)胞胞漿中.氣道上皮細(xì)胞哮喘模型組、BCG10<'5>/OVA組、BCG10<'5-3>/OVA組均呈不同程度的陽性(深棕黃色到淺棕黃色不等)表達(dá),而對照組中呈弱陽性(淺棕黃色)表達(dá).用秩和檢驗,四組樣本總體有顯著差異性,P<0.05.樣本兩

11、兩比較顯示,BCG10<'5-3>/OVA組與對照組、模型組、BCG10<'5-3>/OVA組比較有顯著性差異(n=6,p<0.05). 結(jié)論 1.小鼠生命早期接種BCG,預(yù)防哮喘有長期(25周)作用,同時與BcG接種的劑量大小有關(guān). 2.IL-10對哮喘起保護性調(diào)節(jié)作用,可能與APC的免疫調(diào)節(jié)、Treg的激活、Th2細(xì)胞的抑制等有關(guān). 3.BCG治療后VCAM-1表達(dá)的升高,可能對哮喘小鼠免疫調(diào)節(jié)起一定