減毒活菌卡介苗(BCG)早期接種對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥保護(hù)作用及其免疫機(jī)制研究.pdf

1、本研究主要分兩部分：(1)首先討論在靜息狀態(tài)以及OVA攻擊后，BCG接種對(duì)肺組織、脾臟以及引流淋巴結(jié)內(nèi)輔助T細(xì)胞以及Treg的改變，我們發(fā)現(xiàn)只有表達(dá)IFN-γ的CD4+T細(xì)胞在OVA攻擊后向肺臟發(fā)生明顯遷移，而且這種轉(zhuǎn)移來(lái)自BCG接種部位的引流淋巴結(jié)而不是脾臟；(2)接下來(lái)我們系統(tǒng)分析了引流淋巴結(jié)內(nèi)CD4+T細(xì)胞的表型以及功能變化，通過(guò)過(guò)繼試驗(yàn)和體內(nèi)示蹤證實(shí)引流淋巴結(jié)內(nèi)的CD4+T細(xì)胞參與了肺組織的遷移以及抑制哮喘氣道炎癥的作用。本研究

2、為BCG接種防治哮喘提供更有說(shuō)服力的試驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為哮喘的免疫治療提供了新的方向。
　　 第一部分：BCG早期皮下接種抑制哮喘小鼠氣道炎癥以及氣道高反應(yīng)性，該作用與表達(dá)IFN-γ的CD4+T細(xì)胞向肺組織募集相關(guān)
　　 目的：①探討早期BCG接種對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的保護(hù)作用；②探討B(tài)CG接種后靜息以及OVA攻擊后機(jī)體的輔助T細(xì)胞以及Treg的變化。
　　 方法：①新生鼠接種BCG，待到6-8W后，分為

3、三組：正常對(duì)照組，哮喘組和BCG處理組。以O(shè)VA致敏和激發(fā)建立哮喘模型。最后一次抗原激發(fā)后24小時(shí)檢測(cè)氣道反應(yīng)性，行支氣管肺泡灌洗液收集、肺組織病理切片觀察炎癥浸潤(rùn)以及黏液分泌，檢測(cè)肺組織內(nèi)IFN-γ、Foxp3以及IL-17A的mRNA表達(dá)，ELISA行BALF中IFN-γ測(cè)定；②為了系統(tǒng)觀察BCG接種后靜息以及OVA攻擊后肺臟的輔助T細(xì)胞以及Treg變化，同時(shí)流式檢測(cè)肺門縱隔淋巴結(jié)，脾臟以及腹股溝淋巴結(jié)內(nèi)表達(dá)IFN-γ的CD4+和C

4、D8+T細(xì)胞。
　　 結(jié)果：①saline/OVA組小鼠氣道反應(yīng)性，BALF中Eos總數(shù)，肺組織炎癥浸潤(rùn)以及黏液分泌均較saline/saline明顯增加。與saline/OVA組相比，早期接種BCG顯著抑制了哮喘小鼠BALF中的Eos數(shù)，減輕了AHR，抑制了肺組織的氣道炎癥以及黏液分泌。同時(shí)，BCG接種增加了肺組織中IFN-γ的mRNA表達(dá)，而不影響Foxp3和IL-17A的mRNA表達(dá)。②在靜息狀態(tài)下，BCG接種輕度增加了肺

5、組織中表達(dá)IFN-γ的CD4+T細(xì)胞，而不改變表達(dá)IFN-γ的CD8+T細(xì)胞，表達(dá)IL-17的CD4+T細(xì)胞以及CD8+T細(xì)胞的比例，同樣，BCG接種不增加肺組織內(nèi)Foxp3+Treg細(xì)胞的比例；相對(duì)于靜息狀態(tài)而言，BCG接種小鼠在OVA致敏攻擊后顯著增加了肺組織內(nèi)表達(dá)IFN-γ的CD4+T細(xì)胞。雖然也顯著增加了表達(dá)IFN-γ的CD8+T細(xì)胞，但是，表達(dá)IFN-γ的CD8+T細(xì)胞僅僅為表達(dá)IFN-γ的CD4+T細(xì)胞的1/6。這提示OVA

6、致敏攻擊，導(dǎo)致大量表達(dá)IFN-γ的CD4+T細(xì)胞向BCG接種小鼠肺組織的募集。相反，Th17，表達(dá)IL-17A的CD8+T細(xì)胞以及Foxp3+Treg細(xì)胞沒(méi)有出現(xiàn)與Th1細(xì)胞相似的變化。③靜息狀態(tài)下，BCG接種沒(méi)有改變脾臟、縱隔淋巴結(jié)內(nèi)Th1細(xì)胞和表達(dá)IFN-γ的CD8+T細(xì)胞。出乎意料的是，OVA致敏攻擊后，BCG接種顯著增加了脾臟內(nèi)表Th1細(xì)胞，但不改變表達(dá)IFN-γ的CD8+T細(xì)胞；與之對(duì)應(yīng)的是，BCG接種后靜息狀態(tài)下ILN內(nèi)增高

7、的Th1細(xì)胞在OVA致敏攻擊后明顯減少，而表達(dá)IFN-γ的CD8+T細(xì)胞沒(méi)有觀察到相似的變化。
　　 結(jié)論：①BCG皮下尾根部接種能夠抑制哮喘小鼠的氣道炎癥以及氣道高反應(yīng)性，這種抑制作用與迅速導(dǎo)致Th1細(xì)胞向炎癥肺組織的募集相關(guān)，而與Th17，表達(dá)IL-17A的CD8+T細(xì)胞以及Foxp3+Treg無(wú)關(guān)；③OVA致敏攻擊后，BCG接種小鼠肺內(nèi)增高的Th1細(xì)胞來(lái)自于ILN，通過(guò)脾臟向肺內(nèi)遷移，從而達(dá)到抑制哮喘氣道炎癥的作用。

8、>　　 第二部分：BCG接種部位的局部引流淋巴結(jié)內(nèi)CD4+T細(xì)胞的表型及體外功能研究
　　 目的：進(jìn)一步探討B(tài)CG接種后局部引流淋巴結(jié)內(nèi)CD4+T細(xì)胞的表型以及功能。
　　 方法：BCG接種方法同前。小鼠分為兩組：正常對(duì)照組和BCG接種組。動(dòng)態(tài)觀察BCG接種后ILN和脾臟的細(xì)胞數(shù)改變；由于第一部分我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BCG接種12W后ILN內(nèi)Th1細(xì)胞增高，為了進(jìn)一步證實(shí)這一現(xiàn)象，繼續(xù)觀察BCG接種18W以及30W后ILN和脾

9、臟中表達(dá)IFN-γ的CD4+T和CD8+T細(xì)胞的變化；以12W為時(shí)間點(diǎn)，流式檢測(cè)ILN和脾臟內(nèi)表達(dá)IL-17A的CD4+T和CD8+T細(xì)胞以及Foxp3+Treg細(xì)胞比例。以12W為時(shí)間點(diǎn)，定量PCR測(cè)定ILN內(nèi)IFN-γ、IL-17A以及Foxp3的mRNA水平，同時(shí)分析ILN內(nèi)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞周期、CD4+T細(xì)胞的活化程度以及表型；以MTT法以及CFSE稀釋法檢測(cè)ILN內(nèi)淋巴細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的體外增殖能力，同時(shí)ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上

10、清內(nèi)IFN-γ的水平.
　　 結(jié)果：①BCG接種促進(jìn)了ILN細(xì)胞數(shù)呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，但不改變脾臟的細(xì)胞數(shù)。②無(wú)論18W還是30W，BCG接種均促進(jìn)了ILN內(nèi)表達(dá)IFN-γ的CD4+T細(xì)胞比例的增加。而對(duì)于脾臟細(xì)胞，BCG接種均不改變表達(dá)IFN-γ的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的百分比。同樣，BCG接種不改變ILN和脾臟內(nèi)Th17細(xì)胞和表達(dá)IL-17的CD8+T細(xì)胞，以及Foxp3+CD4+T細(xì)胞。與之相一致的是：BCG接種促進(jìn)了I

11、LN內(nèi)IFN-γ和轉(zhuǎn)錄因子T-bet的mRNA表達(dá)，而不改變IL-17A和Foxp3轉(zhuǎn)錄因子的mRNA水平；③BCG接種輕度增加了ILN內(nèi)效應(yīng)和/或效應(yīng)記憶CD4+T細(xì)胞，而對(duì)于處女型T細(xì)胞和中央記憶型T細(xì)胞CD4+T細(xì)胞沒(méi)有明顯改變；BCG接種不改變ILN細(xì)胞的增殖指數(shù)，不改變ILN內(nèi)CD4+T細(xì)胞的活化程度。但是體外刺激后，BCG接種后的ILN細(xì)胞表現(xiàn)為活化程度顯的著增高，體外增殖能力的增強(qiáng)以及IFN-γ分泌能力的上升.
　　

12、 結(jié)論：①BCG接種促進(jìn)了ILN而不是脾臟的增生并且導(dǎo)致ILN內(nèi)儲(chǔ)存大量表達(dá)IFN-γ的CD4+T細(xì)胞，而不改變表達(dá)IFN-γ的CD8+T細(xì)胞，Th17細(xì)胞，表達(dá)IL-17的CD8+T細(xì)胞，以及Foxp3+CD4+T細(xì)胞比例。②BCG接種導(dǎo)致的ILN內(nèi)的CD4+T細(xì)胞處在一種相對(duì)靜息的狀態(tài)，但是一旦給予刺激，表現(xiàn)出增強(qiáng)的活化增殖以及分泌效應(yīng)因子能力.
　　 第三部分：BCG接種誘導(dǎo)的局部引流淋巴結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞參與OVA激發(fā)后向肺

13、組織的募集以及發(fā)揮對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的保護(hù)作用
　　 目的：進(jìn)一步探討B(tài)CG接種以后富集表達(dá)IFN-γ的CD4+T細(xì)胞的ILN細(xì)胞是否參與了OVA致敏激發(fā)后向肺臟組織的募集以及這些淋巴細(xì)胞是否參與了抑制哮喘氣道炎癥的作用。
　　 方法：①本部分試驗(yàn)分兩步走，早期接種BCG，這些小鼠待作過(guò)繼免疫時(shí)的“供者小鼠”。同時(shí)另選一批小鼠用作哮喘模型，作為細(xì)胞過(guò)繼的“受者小鼠”。小鼠8W開(kāi)始建立哮喘模型?！笆苷咝∈蟆痹贠VA激發(fā)前一

14、天，接受來(lái)自于“供者小鼠”的ILN單個(gè)核細(xì)胞懸液，后誘發(fā)哮喘模型。小鼠分為3組：BCG接種ILN細(xì)胞過(guò)繼OVA攻擊組(BCG-ILN/OVA)，生理鹽水對(duì)照ILN細(xì)胞過(guò)繼OVA攻擊組和過(guò)繼PBS對(duì)照OVA攻擊組。于最后一次抗原激發(fā)后24小時(shí)檢測(cè)氣道反應(yīng)性，48小時(shí)行支氣管肺泡灌洗、肺組織病理切片觀察炎癥浸潤(rùn)以及黏液分泌情況以及檢測(cè)Th1細(xì)胞因子的表達(dá)。在另一單獨(dú)試驗(yàn)中，過(guò)繼脾臟細(xì)胞，分組基本同ILN細(xì)胞過(guò)繼，分為：BCG-spleen/

15、OVA，saline-spleen/OVA以及PBS/OVA，后檢測(cè)氣道反應(yīng)性、支氣管肺泡灌洗液、肺組織病理切片觀察炎癥浸潤(rùn)以及黏液分泌情況。②另外，為直接證實(shí)BCG接種后的ILN內(nèi)的淋巴細(xì)胞以及CD4+T細(xì)胞是否具有向炎癥肺組織遷移的優(yōu)先能力，我們?cè)O(shè)立三組：CFSE標(biāo)記的BCG接種ILN細(xì)胞過(guò)繼OVA攻擊組，CFSE標(biāo)記的saline對(duì)照ILN細(xì)胞過(guò)繼OVA攻擊組以及CFSE標(biāo)記的BCG接種ILN細(xì)胞過(guò)繼saline攻擊對(duì)照組(BCG

16、-ILN/OVA)。細(xì)胞體外CFSE標(biāo)記，行尾靜脈過(guò)繼，誘發(fā)哮喘模型。流式檢測(cè)CFSE陽(yáng)性的淋巴細(xì)胞以及CD4+T細(xì)胞數(shù)。③分別取8W時(shí)BCG接種以及正常對(duì)照組的ILN組織，定量PCR檢測(cè)趨化因子受體CXCR3，CCR5，CXCR6，CCR6，CCR4和CCR8的mRNA水平；另外，分別檢測(cè)OVA致敏攻擊組和生理鹽水對(duì)照組的肺組織，定量PCR檢測(cè)CXCR3相匹配的趨化因子CXCL9，CXCL10和CXCL11的mRNA水平。
　　

17、 結(jié)果：①過(guò)繼BCG接種后的ILN細(xì)胞，表現(xiàn)為氣道反應(yīng)性的降低，BALF中Eos數(shù)的下調(diào)，以及肺組織炎癥和黏液分泌的減輕，值得注意的是，這些小鼠同時(shí)伴隨著肺組織增高的IFN-γmRNA水平以及BALF中IFN-γ的表達(dá)的增加；②無(wú)論過(guò)繼BCG接種或者對(duì)照組的脾臟細(xì)胞懸液，均不能降低哮喘小鼠的病理生理改變；③與saline-ILN/OVA相比，CFSE陽(yáng)性的淋巴細(xì)胞(p=0.022)以及CD4+T細(xì)胞(p=O.045)在BCG-ILN/

18、OVA組肺組織中顯著增高。④BCG接種后ILN組織選擇性的高表達(dá)Th1細(xì)胞表面趨化因子受體CXCR3，而不增高其他T細(xì)胞相關(guān)的趨化因子受體。與之相對(duì)應(yīng)的是，OVA致敏攻擊后的肺組織高表達(dá)與CXCR3匹配的趨化因子CXCL9、CXCL1O和CXCL11。
　　 結(jié)論：BCG接種引起的增生引流淋巴結(jié)(ILN)具有直接保護(hù)哮喘氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的作用，而脾臟細(xì)胞不具有這樣的保護(hù)作用，這種保護(hù)作用與ILNCD4+T細(xì)胞優(yōu)先向肺部炎癥