早期多次卡介苗接種對(duì)哮喘小鼠氣道重塑的影響及相關(guān)免疫機(jī)制研究.pdf

1、支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘）是一種以嗜酸性粒細(xì)胞（Eosinophils，Eos）、肥大細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主的氣道慢性炎癥性疾病，表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)性和可逆性氣流受限。氣道炎癥的反復(fù)發(fā)生或持續(xù)存在會(huì)使氣道出現(xiàn)不可逆的結(jié)構(gòu)改變，稱(chēng)為氣道重塑，其特征主要有：氣道周?chē)交≡錾?肥大，上皮下纖維化和膠原沉積，上皮細(xì)胞黏液化生和黏液高分泌以及微血管的增生。當(dāng)哮喘發(fā)展至氣道重塑階段會(huì)出現(xiàn)氣流受限的不完全可逆，患者對(duì)抗炎治療的反應(yīng)下降而使預(yù)后交差。

2、r>　　 哮喘嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，其發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)有增高趨勢(shì)。目前全球有超過(guò)3億哮喘患者，我國(guó)約有3900萬(wàn)哮喘患者?，F(xiàn)行的以吸入糖皮質(zhì)激素為首選的治療方案能控制哮喘癥狀，但需長(zhǎng)期用藥，不能預(yù)防及根治其發(fā)生，也不能抑制氣道重塑的發(fā)生。如何從哮喘的發(fā)病機(jī)制入手尋找一有效的哮喘預(yù)防手段是目前面臨的難題。
　　 現(xiàn)有研究表明哮喘是一種免疫失衡性疾病，哮喘的發(fā)生與機(jī)體IFN-γ的微環(huán)境缺失和Th2細(xì)胞免疫的過(guò)度存在相關(guān)，大量Th2

3、細(xì)胞因子（IL-4，IL-5，IL-13等）的增加，促進(jìn)了IgE的釋放，致使肺組織嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和氣道黏液高分泌，導(dǎo)致氣道反應(yīng)性的增高和氣道重塑的發(fā)生。通過(guò)糾正機(jī)體失衡的Thl/Th2免疫反應(yīng)成為預(yù)防哮喘研究的熱點(diǎn)和靶點(diǎn)。
　　 減毒活菌卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)是一種很強(qiáng)的Thl免疫刺激劑，多項(xiàng)動(dòng)物研究顯示，BCG干預(yù)可明顯抑制抗原致敏激發(fā)所致的氣道Eos浸潤(rùn)，降低氣道高反應(yīng)性。流行病

4、學(xué)研究關(guān)于人體BCG接種與哮喘發(fā)生的關(guān)系雖然有爭(zhēng)議，但是最近一項(xiàng)對(duì)23項(xiàng)臨床研究的薈萃分析結(jié)果表明，人類(lèi)生命早期接種BCG疫苗能夠降低兒童哮喘發(fā)生率，進(jìn)一步支持了BCG接種能夠預(yù)防哮喘發(fā)生的觀點(diǎn)。
　　 BCG接種對(duì)哮喘的抑制作用與多種因素有關(guān)，包括BCG結(jié)構(gòu)重組，采用不同的接種途徑、接種次數(shù)以及改變接種時(shí)間窗等。多年來(lái)我們實(shí)驗(yàn)室致力于尋求一種最有效的、安全的、有望應(yīng)用于人類(lèi)的接種方式。通過(guò)一系列的前期研究，我們發(fā)現(xiàn)新生兒期幼鼠

5、多次皮下給予小劑量BCG接種可以抑制成年后哮喘的發(fā)生，并且該保護(hù)作用能維持至老年。既然BCG早期多次接種能長(zhǎng)期抑制哮喘氣道炎癥，那么是否可以進(jìn)一步抑制與炎癥持續(xù)存在相關(guān)的氣道重塑的發(fā)生呢？目前為止，有關(guān)早期多次BCG接種對(duì)哮喘氣道重塑的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 其次是關(guān)于BCG接種抑制哮喘發(fā)生的免疫機(jī)制問(wèn)題。雖然多數(shù)研究均證實(shí)BCG是一很強(qiáng)的Thl免疫刺激劑，但隨著調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）和新

6、型Th細(xì)胞（Thl7細(xì)胞）的發(fā)現(xiàn)以及功能的不斷研究，BCG是否通過(guò)Treg或Thl7來(lái)抑制哮喘發(fā)生也受到重視。有研究發(fā)現(xiàn)IL-17能夠促進(jìn)機(jī)體對(duì)結(jié)核桿菌最佳的Thl免疫反應(yīng)，介導(dǎo)T細(xì)胞分泌IFN-γ，并促進(jìn)表達(dá)IFN-γ的CD4+T細(xì)胞向肺內(nèi)遷移，從而在結(jié)核桿菌疫苗干預(yù)哮喘的過(guò)程中發(fā)揮作用。也有研究認(rèn)為結(jié)核桿菌疫苗能夠通過(guò)誘導(dǎo)Treg增殖抑制哮喘炎癥。但以上研究多基于急性炎癥模型或體外研究。而現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，慢性或重癥哮喘與急性或輕癥哮喘

7、患者中多種炎癥因子的表達(dá)存在明顯差異，如在慢性持續(xù)性或重癥哮喘患者中Thl7細(xì)胞比例和IL-17的表達(dá)明顯高于輕癥患者?；诒狙芯恐形覀兪褂玫氖锹詺獾乐厮苣Ｐ?，我們有興趣觀察BCG早期接種在慢性哮喘中的免疫調(diào)節(jié)模式，而這方面目前鮮見(jiàn)報(bào)道。
　　 由此，本實(shí)驗(yàn)分兩部分進(jìn)行研究：（1）通過(guò)構(gòu)建小鼠哮喘氣道重塑模型，觀察新生期多次BCG接種對(duì)小鼠哮喘氣道重塑發(fā)生的影響；（2）通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和real-time PCR檢測(cè)早期多次BC

8、G接種后肺組織T細(xì)胞亞群的變化，從而了解早期多次皮下接種BCG在氣道重塑模型中的免疫應(yīng)答情況。
　　 第一部分：小鼠哮喘氣道重塑模型的建立及早期多次卡介苗接種對(duì)氣道重塑的影響
　　 目的：通過(guò)抗原致敏和反復(fù)激發(fā)建立具有典型氣道重塑特征的慢性哮喘模型。觀察早期多次卡介苗接種對(duì)哮喘氣道重塑的影響。
　　 方法：采用BALB/c新生鼠，分為OVA致敏激發(fā)組（OVA組）、早期多次BCG接種組（BCG+OVA組）和生理鹽水

9、陰性對(duì)照組（SHAM組）。BCG+OVA組小鼠分別在出生O、7、14天予以BCG105CFUs的劑量行皮下接種3次，OVA組和SHAM組注射等體積注射用水。小鼠長(zhǎng)大至5周時(shí)予OVA腹腔注射致敏，2周后第二次致敏，10天后以1％OVA霧化吸入激發(fā)，每次40min，每周連續(xù)霧化吸入3天，連續(xù)8周。最后一次激發(fā)后24小時(shí)行氣道反應(yīng)性測(cè)定。48小時(shí)收集標(biāo)本，行支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)，肺組織病理切片觀察氣道炎癥、氣道周?chē)交≡錾?、膠原沉積

10、和黏液分泌情況。
　　 結(jié)果：OVA組小鼠經(jīng)抗原致敏和反復(fù)激發(fā)后出現(xiàn)了典型的氣道重塑特征，包括氣道周?chē)交∶黠@增生、膠原沉積增加、氣道黏液高分泌以及氣道和血管周?chē)罅垦装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)氣道反應(yīng)性明顯增高。而早期多次BCG接種后的小鼠（BCG+OVA組）BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)減少，尤其Eos減少更明顯（P﹤0.01）。氣道周?chē)交≡錾湍z原沉積較OVA組減少，尤其以直徑150-250μm的小氣道周?chē)鷾p少明顯（P﹤0.05）。氣

11、道反應(yīng)性也較OVA組降低（P﹤0.05）。
　　 結(jié)論：我們通過(guò)OVA抗原致敏和反復(fù)霧化吸入激發(fā)的方法構(gòu)建了穩(wěn)定的具有典型氣道重塑特征和氣道高反應(yīng)性的小鼠慢性哮喘模型。新生鼠早期多次BCG接種可降低慢性哮喘模型氣道周?chē)装Y細(xì)胞尤其是Eos的浸潤(rùn)，減輕氣道周?chē)交≡錾湍z原沉積，降低氣道高反應(yīng)性，其中對(duì)小氣道周?chē)鷼獾乐厮艿囊种戚^中大氣道更為明顯。
　　 第二部分：早期多次卡介苗接種減輕哮喘氣道重塑的相關(guān)免疫機(jī)制
　

12、　 目的：觀察早期多次BCG接種后肺組織T細(xì)胞免疫應(yīng)答的變化。觀察BCG接種對(duì)肺組織中Eos活化因子和趨化因子表達(dá)的影響，以及對(duì)影響氣道重建的重要因子TGF-β1表達(dá)的影響。
　　 方法：最后一次抗原激發(fā)后48小時(shí)行肺泡灌洗，ELISA法檢測(cè)灌洗液上清中IFN-γ、IL-5、IL-17、IL-13、eotaxin-1、TGF-βl的水平。分離肺組織淋巴細(xì)胞，經(jīng)PMA刺激后行表面抗體標(biāo)記（CD3，CD4，CD8，CD25），細(xì)胞

13、破膜處理后標(biāo)記胞內(nèi)抗體（IFN-γ，IL-4，IL-17A，IL-10，F(xiàn)oxp3），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和分析各T細(xì)胞亞群的比例。另取肺組織提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后用real-time PCR法檢測(cè)IFN-γ，IL-17A和Fopx3mRNA的表達(dá)。肺組織石蠟切片行TGF-β1免疫組化染色，圖像分析計(jì)數(shù)氣道基底膜外圍30μmm范圍內(nèi)TGF-β1+細(xì)胞數(shù)。
　　 結(jié)果：與SHAM組相比，OVA組表達(dá)IL-4和表達(dá)IL-17的T細(xì)胞比例增

14、高，而表達(dá)IFN-γ的T細(xì)胞比例無(wú)明顯變化。BCG多次接種后肺組織中表達(dá)IFN-γ的T細(xì)胞明顯增高達(dá)4倍，尤其表現(xiàn)為T(mén)hl細(xì)胞的增加（5.01±0.66％ vs0.83±0.18％ ofCD3+T cells，BCG+OVA vs OVA，P﹤0.01）。Thl7細(xì)胞、Th2細(xì)胞和Treg在OVA組和BCG+OVA組之間無(wú)明顯差別。real-time PCR檢測(cè)結(jié)果與流式分析的結(jié)果一致，BCG接種后僅發(fā)現(xiàn)促進(jìn)FN-γmRNA明顯增高，而

15、IL-17A和Fopx3mRNA水平在BCG+OVA組與OVA組之間無(wú)明顯差異，但這兩組的IL-17AmRNA水平均較SHAM組明顯增高。用ELISA方法檢測(cè)BALF中細(xì)胞因子表達(dá)水平，結(jié)果顯示：OVA組和SHAM組IFN-γ水平無(wú)明顯差異，BCG接種組IFN-γ較未接種組明顯增高（P﹤0.05）。OVA組BALF中IL-5和Eotaxin-1水平較SHAM組顯著增加，BCG+OVA組IL-5和Eotaxin-1水平均下降，兩組間相比差

16、異有顯著性。IL-13水平OVA組較SHAM組高，BCG+OVA組較OVA組有下降，但統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著差異。IL-17水平各組中均很低，在檢測(cè)的敏感性之外。BALF中TGF-β1水平用ELISA方法檢測(cè)結(jié)果顯示：OVA組BALF中TGF-β1水平較SHAM組顯著增加，BCG+OVA組TGF-β1水平較OVA組下降，兩組間相比差異有顯著性。肺組織切片TGF-β1免疫組化染色發(fā)現(xiàn)：OVA組氣道周?chē)鶷GF-β1染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)較SHAM組明顯增高，