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文檔簡介
1、結(jié)核分枝桿菌是造成結(jié)核病的主要病原,結(jié)核病作為一種世界性的疾病,在全世界范圍內(nèi)造成了巨大的精神和物質(zhì)傷害。在完成結(jié)核分枝桿菌群基因組測序后,發(fā)現(xiàn)了一個在全基因組中占有10%的比重的一個家族---PE和PPE家族,而PE家族根據(jù)其C端的序列的不同特點分為pe和pe-pgrs亞家族,PPE家族分為ppe-mptr(majorpolymor phictandem repeats), ppe-svp(with a GxxSVPxxW motif
2、), ppe-ppw(with aPxxPxxW motif)和ppe(with no distinctive features)亞家族,本研究中涉及到的基因Wag22屬于e-pgrs亞家族,該家族特點是C端序列的高GC含量(≥60%)且含有非常多的GC重復(fù)序列,這就增大了體外擴增目的基因的難度。只有少量的文獻對Wag22有報道,指出Wag22只有在感染宿主后才會表達,且表達產(chǎn)物Wag22蛋白具有纖維連接蛋白活性,可能在結(jié)核分枝桿菌感染
3、宿主的早期發(fā)揮一定的作用。本研究以卡介苗BCG為親本菌株,敲除目的基因Wag22后對小鼠巨噬細胞RAW264.7的影響來探討目的基因在感染宿主時所發(fā)揮的作用,同時在獲得缺失株的基礎(chǔ)上,利用BCG和缺失株建立一個潛伏感染的動物模型。
(1) BCG基因缺失株的構(gòu)建
本研究構(gòu)建了一個分枝桿菌噬菌體,該噬菌體中含有目的基因上下游同源臂和篩選基因Hyg和sacB的同源重組載體,利用噬菌體感染BCG時將同源重組載體注射到BCG
4、細胞內(nèi),發(fā)生同源重組后利用篩選基因篩選出陽性克隆子,最后用PCR的方法對陽性克隆子進行鑒定,將鑒定正確的陽性克隆子進行測序,檢測目的基因區(qū)域的序列。最后成功獲得BCG基因缺失株BCG△Wag22。
(2)缺失株BCG△Wag22表型的變化
成功獲得突變株后,我們對突變株和BCG進行了菌落形態(tài)、生長曲線、細胞毒性、抗吞噬和存活能力的檢測。發(fā)現(xiàn)缺失Wag22后菌落形態(tài)和生長曲線沒有明顯差異,但在抗吞噬和存活能力檢測方面,
5、BCG△Wag22更易被吞入巨噬細胞內(nèi),吞入細胞后,在胞內(nèi)的存活率沒有差別。而細胞毒性方面缺失株對細胞的毒性稍大一些,這些表型的變化可能代表缺失株BCG△Wag22更容易進入宿主并長期在宿主內(nèi)存在,刺激機體產(chǎn)生長期的免疫力。
(3)蛋白Wag22的體外表達
由于Wag22只在感染宿主后才表達,所以我們對目的基因進行體外原核表達,選取pET-28a原核表達載體成功構(gòu)建了Wag22-pET-28a質(zhì)粒,在體外獲得了包涵體
6、蛋白,并對包涵體蛋白進行復(fù)性,獲得了復(fù)性后的Wag22蛋白。但由于蛋白的濃度過低無法進行下一步實驗,我們會嘗試其他的表達方法完成這個實驗。
(4)潛伏感染動物模型的建立
我們利用缺失株BCG△Wag22和BCG來建立潛伏感染模型,選擇的實驗動物為6-8周齡雌性BABL/C小鼠,以尾靜脈注射的方式向小鼠體內(nèi)注入5×105CFU/200μL的細菌,在兩個月的實驗時間內(nèi)觀察結(jié)核病典型病變-肉芽腫,我們選取了三個時間段進行觀
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