卡介苗基因缺失株BCGΔWag22的構(gòu)建及BALB-c小鼠潛伏感染模型的建立.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌是造成結(jié)核病的主要病原，結(jié)核病作為一種世界性的疾病，在全世界范圍內(nèi)造成了巨大的精神和物質(zhì)傷害。在完成結(jié)核分枝桿菌群基因組測序后，發(fā)現(xiàn)了一個在全基因組中占有10％的比重的一個家族---PE和PPE家族，而PE家族根據(jù)其C端的序列的不同特點(diǎn)分為pe和pe-pgrs亞家族，PPE家族分為ppe-mptr(majorpolymor phictandem repeats), ppe-svp(with a GxxSVPxxW motif

2、), ppe-ppw(with aPxxPxxW motif)和ppe(with no distinctive features)亞家族，本研究中涉及到的基因Wag22屬于e-pgrs亞家族，該家族特點(diǎn)是C端序列的高GC含量(≥60％)且含有非常多的GC重復(fù)序列，這就增大了體外擴(kuò)增目的基因的難度。只有少量的文獻(xiàn)對Wag22有報道，指出Wag22只有在感染宿主后才會表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物Wag22蛋白具有纖維連接蛋白活性，可能在結(jié)核分枝桿菌感染

3、宿主的早期發(fā)揮一定的作用。本研究以卡介苗BCG為親本菌株，敲除目的基因Wag22后對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的影響來探討目的基因在感染宿主時所發(fā)揮的作用，同時在獲得缺失株的基礎(chǔ)上，利用BCG和缺失株建立一個潛伏感染的動物模型。
　　(1) BCG基因缺失株的構(gòu)建
　　本研究構(gòu)建了一個分枝桿菌噬菌體，該噬菌體中含有目的基因上下游同源臂和篩選基因Hyg和sacB的同源重組載體，利用噬菌體感染BCG時將同源重組載體注射到BCG

4、細(xì)胞內(nèi)，發(fā)生同源重組后利用篩選基因篩選出陽性克隆子，最后用PCR的方法對陽性克隆子進(jìn)行鑒定，將鑒定正確的陽性克隆子進(jìn)行測序，檢測目的基因區(qū)域的序列。最后成功獲得BCG基因缺失株BCG△Wag22。
　　(2)缺失株BCG△Wag22表型的變化
　　成功獲得突變株后，我們對突變株和BCG進(jìn)行了菌落形態(tài)、生長曲線、細(xì)胞毒性、抗吞噬和存活能力的檢測。發(fā)現(xiàn)缺失Wag22后菌落形態(tài)和生長曲線沒有明顯差異，但在抗吞噬和存活能力檢測方面，

5、BCG△Wag22更易被吞入巨噬細(xì)胞內(nèi)，吞入細(xì)胞后，在胞內(nèi)的存活率沒有差別。而細(xì)胞毒性方面缺失株對細(xì)胞的毒性稍大一些，這些表型的變化可能代表缺失株BCG△Wag22更容易進(jìn)入宿主并長期在宿主內(nèi)存在，刺激機(jī)體產(chǎn)生長期的免疫力。
　　(3)蛋白Wag22的體外表達(dá)
　　由于Wag22只在感染宿主后才表達(dá)，所以我們對目的基因進(jìn)行體外原核表達(dá)，選取pET-28a原核表達(dá)載體成功構(gòu)建了Wag22-pET-28a質(zhì)粒，在體外獲得了包涵體

6、蛋白，并對包涵體蛋白進(jìn)行復(fù)性，獲得了復(fù)性后的Wag22蛋白。但由于蛋白的濃度過低無法進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，我們會嘗試其他的表達(dá)方法完成這個實(shí)驗(yàn)。
　　(4)潛伏感染動物模型的建立
　　我們利用缺失株BCG△Wag22和BCG來建立潛伏感染模型，選擇的實(shí)驗(yàn)動物為6-8周齡雌性BABL/C小鼠，以尾靜脈注射的方式向小鼠體內(nèi)注入5×105CFU/200μL的細(xì)菌，在兩個月的實(shí)驗(yàn)時間內(nèi)觀察結(jié)核病典型病變-肉芽腫，我們選取了三個時間段進(jìn)行觀