UCMSCs和ECFCs聯(lián)合移植及培養(yǎng)基質(zhì)促進(jìn)糖尿病小鼠創(chuàng)面修復(fù)的作用.pdf

1、目的:
　　研究探討臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymalstem cells，UCMSCs)、內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞(endothelial colony-formingcells，ECFCs)、細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)及兩種細(xì)胞聯(lián)合治療糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面的有效性，觀察單種細(xì)胞、細(xì)胞自分泌因子、聯(lián)合細(xì)胞治療糖尿病創(chuàng)面修復(fù)的作用，并探討相關(guān)的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.建立糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)傷模型:將3

2、6只7周齡db/db小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后稱重、測血糖大于16.7mmol/L。麻醉后用直徑為6mm的打孔器在小鼠背部制備圓形創(chuàng)面。
　　2.動物分組:A組:內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞(ECFCs)組(n=6);B組:ECFC-CM(conditioned medium)組(n=6);C組:臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)組(n=6);D組:MSC-CM(conditioned medium)組(n=6);E組:ECFCs及UCMSCs組，即

3、混合細(xì)胞組(n=6);F組:PBS對照組(n=6)。
　　3.細(xì)胞移植:模型建立成功后，在A組、B組分別沿創(chuàng)面旁開2-3mm左右4個位點(diǎn)進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射CM-DiI標(biāo)記的ECFCs和UCMSCs（細(xì)胞注射總量為1*10^6個/只，共100ul）;C組、D組分別采用同上的方法皮下注射用M199培養(yǎng)的同等細(xì)胞數(shù)（1*10^6個）ECFCs和UCMSCs培養(yǎng)基的上清液（100ul/只），即ECFC-CM、UCMSC-CM;E組皮下注射E

4、CFCs及UCMSCs（即0.5*10^6個ECFCs及0.5*10^6個UCMSCs混合細(xì)胞組）;F組為對照組，注射PBS（100ul/只）。移植后，應(yīng)用水膠體敷料覆蓋創(chuàng)面。
　　4.取材觀察指標(biāo):用照相機(jī)每隔一日對所有小鼠創(chuàng)面進(jìn)行拍照，記錄創(chuàng)面愈合情況，同時記錄血糖及體重。分別在細(xì)胞及其培養(yǎng)基移植后第18天取材ECFCs及UCMSCs組小鼠的全層皮膚組織，并制作成冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察CM-DiI標(biāo)記后的細(xì)胞在移植后的具

5、體定位;采用H-E染色法及vWF免疫組化法觀察皮膚組織的新生毛細(xì)血管密度變化;采用Western Blot方法檢測促血管生成因子及信號通路蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　細(xì)胞及培養(yǎng)基質(zhì)移植治療后，每2天監(jiān)測小鼠隨機(jī)體重及血糖，各組小鼠體重隨著時間的延長逐漸增加，組間體重?zé)o明顯差異(P＞0.05);血糖均大于16.7mmol/L，組間血糖無明顯差異（P＞0.05）;創(chuàng)緣可見鮮紅色、顆粒狀、柔軟濕潤的肉芽組織逐漸形成并填補(bǔ)創(chuàng)口組織

6、缺損。移植細(xì)胞組及CM組較對照組（PBS組）傷口愈合時間明顯縮短，其中混合細(xì)胞組傷口愈合最快，其愈合速率較其他各組有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，ECFC、ECFC-CM、UCMSCs、MSC-CM愈合速率無明顯差異（P＞0.05），但比PBS對照組傷口愈合時間短。移植細(xì)胞及其自分泌因子第18天后，用Western Blot檢測創(chuàng)緣皮膚組織中VEGF、AKT、pAKT、ERK1/2的蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示:ECFCs、ECFC-CM、UCM

7、SCs、UCMSC-CM及聯(lián)合移植組的VEGF蛋白含量明顯高于PBSs組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（單獨(dú)移植組P＜0.05，聯(lián)合移植組P＜0.01），細(xì)胞移植及自分泌因子組可使VEGF分泌增加。聯(lián)合移植組VEGF蛋白表達(dá)量高于單獨(dú)移植組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，提示聯(lián)合細(xì)胞移植后VEGF蛋白表達(dá)量最高。單獨(dú)細(xì)胞及自分泌因子移植組VEGF蛋白表達(dá)無明顯變化，組間比較無差異(P＞0.05)。而信號通路蛋白AKT、pAKT、ERK1/2蛋白

8、測定結(jié)果提示，ECFCs、ECFC-CM、UCMSCs、UCMSC-CM及聯(lián)合移植組的表達(dá)量明顯高于PBSs組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（單獨(dú)移植組與PBS組相比，P＜0.05;聯(lián)合移植組與PBS組相比，P＜0.01）;聯(lián)合移植組蛋白表達(dá)量最高，與單獨(dú)移植及自分泌因子組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);單獨(dú)移植組及自分泌組組間比較無差異（P＞0.05）。提示ECFCs及UCMSCs在促進(jìn)創(chuàng)面血管新生、促進(jìn)組織修復(fù)中可能存在自分泌VEGF發(fā)

9、揮作用，而聯(lián)合細(xì)胞移植可能更有利于VEGF自分泌而促進(jìn)血管新生及組織修復(fù)。
　　結(jié)論:
　　1.UCMSCs、ECFCs及其自分泌因子移植能有效促進(jìn)新生血管形成，加速組織修復(fù)。
　　2.UCMSCs和ECFCs兩種細(xì)胞聯(lián)合移植具有協(xié)同作用，比單獨(dú)移植一種細(xì)胞或自分泌因子促血管新生及組織修復(fù)作用更顯著。
　　3.ECFCs及其自分泌因子對糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面的修復(fù)作用可達(dá)到與UCMSCs及其自分泌因子相同的效果，為臨