托里消毒散對(duì)糖尿病創(chuàng)面愈合的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　糖尿病創(chuàng)傷修復(fù)延遲導(dǎo)致難愈性創(chuàng)面、糖尿病足等并發(fā)癥，是糖尿病患者致死和致殘的重要原因。糖尿病難愈性創(chuàng)面致病因素復(fù)雜，存在多種細(xì)胞功能失調(diào)，典型特征包括血管新生減少，炎癥消散延遲和基質(zhì)沉積減少等。托里消毒散出自明代外科學(xué)家陳實(shí)功的著作《外科正宗》，包涵了中醫(yī)“托”和“透”的治療思想。托法（黃芪、當(dāng)歸）流通氣血，防止毒邪內(nèi)陷；透法（白芷、皂角刺）透膿而載毒外泄，是中醫(yī)治療“瘡瘍”的代表性方劑，臨床應(yīng)用取得了良好的療效。本研

2、究應(yīng)用糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)傷模型觀察托里消毒散全方及其拆方托法和透法治療糖尿病創(chuàng)面的效果，評(píng)估其對(duì)創(chuàng)面血管生成、炎癥消散和基質(zhì)沉積等方面的影響，明確托里消毒散治療糖尿病創(chuàng)面的作用靶點(diǎn)；并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討托里消毒散中各種中藥發(fā)揮作用的機(jī)制。
　　方法：
　　1.應(yīng)用大劑量STZ單次尾靜脈注射SD大鼠誘導(dǎo)糖尿病動(dòng)物模型，采用背部皮膚打孔制備皮膚創(chuàng)傷模型，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組）、糖尿病組（DM組），托法組（DM+TUO組）

3、、透法組（DM+TOU組）、全方組（DM+TT）。在創(chuàng)傷后5天、8天、11天、14天各組分別處死大鼠，取創(chuàng)面組織分析。采用 HE染色及 Masson染色觀察創(chuàng)面組織形態(tài)學(xué)變化；應(yīng)用免疫組織化學(xué)、qPCR及Western Blotting法從mRNA和蛋白水平觀察藥物干預(yù)對(duì)糖尿病創(chuàng)面①血管化情況和血管生成相關(guān)因子表達(dá)的影響；②炎癥消退情況及炎癥因子表達(dá)的影響；③基質(zhì)沉積情況及相關(guān)調(diào)節(jié)因子表達(dá)的影響。
　　2.以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HU

4、VEC）為研究對(duì)象，應(yīng)用qPCR、Western Blotting和細(xì)胞免疫熒光方法檢測四種中藥提取物對(duì)HUVEC缺氧條件下HIF-1α表達(dá)及轉(zhuǎn)錄活性的影響。應(yīng)用CCK-8實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和matrigel實(shí)驗(yàn)檢測托里消毒散中當(dāng)歸、黃芪、白芷、皂角刺四種中藥的乙醇提取物對(duì)HUVEC增殖、遷移、成管的影響，并采用主動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)檢測四種中藥提取物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞出芽的作用，評(píng)估四種中藥提取物的體外促血管生成的能力；應(yīng)用Western Blotting

5、法檢測中藥提取物對(duì)血管生成關(guān)鍵通路ERK1/2、PI3K/Akt、eNOS/NO信號(hào)通路的激活作用，觀察ERK1/2、PI3K/Akt、eNOS/NO信號(hào)通路抑制劑對(duì)藥物促血管生成作用的影響。
　　3.以LPS刺激小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7）作為研究炎癥反應(yīng)的細(xì)胞模型，應(yīng)用qPCR、Western Blotting、ELISA法檢測透法中的白芷和皂角刺乙醇提取物對(duì)高糖條件下LPS活化的巨噬細(xì)胞中NLRP3/ASC/caspas

6、e-1/IL-1β炎癥復(fù)合體表達(dá)和活化的影響，檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量和TXNIP的mRNA和蛋白表達(dá)以明確其調(diào)節(jié)NLRP3炎癥復(fù)合體的可能機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.動(dòng)物造模情況：糖尿病造模后，糖尿病大鼠血糖明顯高于正常大鼠，體重明顯下降。與 NC組相比，DM組大鼠創(chuàng)面愈合明顯延遲（P＜0.05），出現(xiàn)血管生成減少，炎癥細(xì)胞消散延遲，成纖維細(xì)胞及基質(zhì)沉積減少等典型糖尿病難愈性創(chuàng)面的病理特征。
　　2.創(chuàng)面愈合率和一般指標(biāo)

7、：DM組各時(shí)間點(diǎn)愈合率均明顯低于 NC組；托法組愈合率自創(chuàng)傷后6天開始明顯高于DM組；透法組愈合率自創(chuàng)傷后8天開始明顯高于DM組并在創(chuàng)傷后第10天愈合率超過托法組；全方組愈合率在創(chuàng)傷后第4天開始明顯高于DM組，且以后各時(shí)間點(diǎn)愈合率均高于拆方組。藥物干預(yù)期間糖尿病各組大鼠血糖未見明顯差異，觀察終點(diǎn)（創(chuàng)傷后14天）各藥物干預(yù)組大鼠體重高于DM組大鼠。
　　3.創(chuàng)面血管生成及相關(guān)因子表達(dá)情況：與 NC組相比，DM組創(chuàng)面內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD

8、31和周細(xì)胞標(biāo)記物desmin染色明顯減少，VEGF、VEGFR-2、PDGF、PDGFR-β的表達(dá)明顯降低。托法組、透法組和全方組大鼠創(chuàng)面CD31和desmin染色及VEGF、VEGFR-2、PDGF、PDGFR-β的表達(dá)較DM組明顯增加，其中全方組好于托法組，托法組好于透法組。創(chuàng)傷后5天，與NC組相比，DM組大鼠創(chuàng)面HIF-1α水平明顯減少，托法組和全方組大鼠創(chuàng)面HIF-1α水平較DM組明顯升高。
　　4.創(chuàng)面炎癥消退、基質(zhì)沉

9、積及相關(guān)因子表達(dá)情況：創(chuàng)傷后11天，與NC組相比， DM組大鼠創(chuàng)面巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD68和中性粒細(xì)胞標(biāo)記物MPO免疫組化染色及促炎介質(zhì)IL-1β、TNF-α及蛋白酶MMP-9表達(dá)明顯增多，促愈合因子TGF-β1表達(dá)明顯減少；透法組和全方組創(chuàng)面CD68和MPO染色，IL-1β、TNF-α和MMP-9表達(dá)較DM組明顯減少，托法組、透法組和全方組TGF-β1表達(dá)均較DM組明顯增加。創(chuàng)傷后14天，與NC組相比，DM組創(chuàng)面COLⅠ染色明顯減少，托

10、法組、透法組和全方組COLⅠ染色較DM組明顯增加，全方組高于拆方組，透法組高于托法組。
　　二、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.當(dāng)歸、黃芪、白芷和皂角刺四種中藥提取物對(duì)缺氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α表達(dá)和功能的影響：與低糖組相比，高糖組缺氧條件下HIF-1α的mRNA水平無明顯差異，但蛋白表達(dá)明顯減少，免疫熒光染色顯示HIF-1α核轉(zhuǎn)位明顯少于低糖組。當(dāng)歸和黃芪提取物可明顯增加HIF-1α的mRNA和蛋白水平，還可促進(jìn)HIF-1α的核

11、轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性。
　　2.當(dāng)歸、黃芪、白芷和皂角刺四種中藥提取物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞體外血管生成能力的影響：當(dāng)歸、黃芪、白芷和皂角刺提取物均明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，當(dāng)歸、黃芪和白芷提取物還可明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和成管，黃芪和白芷提取物明顯增加大鼠主動(dòng)脈環(huán)的出芽。黃芪和白芷提取物可激活內(nèi)皮細(xì)胞中的 ERK1/2、PI3K/Akt、eNOS/NO信號(hào)通路，使用這些信號(hào)通路的抑制劑可明顯抑制二者的促血管生成活性。
　　3.白芷、皂角刺提取物對(duì)

12、巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥復(fù)合體的影響：高糖增加巨噬細(xì)胞中pro-caspase-1和pro-IL-1β的表達(dá)，并增加pro-caspase-1和pro-IL-1β的剪切以及活性IL-1β的釋放，葡萄糖濃度對(duì)巨噬細(xì)胞中NLRP3和ASC的表達(dá)水平無明顯影響。皂角刺和白芷刺提取物預(yù)處理均可明顯降低pro-IL-1β的表達(dá)水平，白芷提取物預(yù)處理還可明顯減少pro-caspase-1的表達(dá)和剪切、pro-IL-1β的剪切及活性IL-1β的釋放。高

13、糖明顯增加巨噬細(xì)胞中的ROS含量和TXNIP的表達(dá)，白芷提取物可減少巨噬細(xì)胞中的ROS含量和TXNIP的蛋白水平。
　　結(jié)論：
　　1、托里消毒散全方及其拆方托法和透法均具有明顯改善糖尿病創(chuàng)面愈合的作用。其中，托法在創(chuàng)傷早期作用明顯，透法在中后期效果顯著，托里消毒散全方效果優(yōu)于拆方。
　　2.托法改善糖尿病創(chuàng)面的血管生成和血管成熟，其機(jī)制與當(dāng)歸和白芷增加HIF-1α的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄功能，上調(diào)促血管生成因子的表達(dá)有關(guān)。