血管緊張素-(1-7)對心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)作用.pdf

1、心肌缺血再灌注(Ischemia-reperfusion，IR)損傷是常見的臨床現(xiàn)象，普遍存在于急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)及其溶栓(Thrombolysis)治療、心臟移植(Heart transplantation)、冠脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypassgrafting，CABG)、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(Percutaneous coronary interv

2、ention，PCI)等過程中，缺血再灌注損傷(Ischemia-repeffusion iniury，IRI)的機(jī)制目前尚無定論。IRI發(fā)生的中心環(huán)節(jié)包括鈣超載(Calcium overload)、氧化應(yīng)激損傷(Oxidative stress injury)、啟動細(xì)胞凋亡(Apoptosis)等。研究表明，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system，RAS)參與了IRI病理生理過程。因此，通過干擾RAS系

3、統(tǒng)，可能減輕IRI。血管緊張素-(1-7)[Angiotensin-(1-7)，Ang-(1-7)]是RAS系統(tǒng)中近年才逐漸被認(rèn)識的又一重要的活性多肽。它在內(nèi)切酶的作用下由Ang-Ⅰ或Ang-Ⅱ裂解而成。Ang-(1-7)具有與Ang-Ⅱ相拮抗的生理作用，如抑制Ang-Ⅱ引起的血管收縮、平滑肌和心肌細(xì)胞的肥大等。另外，Ang-(1-7)可減輕Ang-Ⅱ介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載；也可直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，

4、而擴(kuò)張血管。因此，可以推測在缺血再灌注過程中，Ang-(1-7)也有可能與Ang-Ⅱ的作用相反，對心肌具有保護(hù)作用。在缺血再灌注之前或期間，如果給予外源性Ang-(1-7)或使內(nèi)源性Ang-(1-7)的生成增多，有可能直接作用于心肌細(xì)胞，抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載和自由基產(chǎn)生，抑制細(xì)胞凋亡，使缺血再灌注損傷減輕。
　　 有研究發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白70(Heat shock protein70，HSP70)具有心肌保護(hù)作用，包括增強(qiáng)心肌收縮力、

5、縮小心肌缺血壞死范圍、抗心律失常作用等。HSP70對損傷心肌保護(hù)作用與其阻止再灌注損傷時氧自由基的釋放和細(xì)胞內(nèi)鈣反常及抗炎作用有關(guān)。此外，HSP可以通過兩條通路阻斷細(xì)胞的凋亡：①阻斷細(xì)胞色素介導(dǎo)的凋亡通路；②抑制細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激酶((jun N-teriminal kinase，JNK)的激活。HSP70與細(xì)胞色素C和HSP21的復(fù)合物結(jié)合可阻斷HSP29前體的活化，從而阻斷信號通路，抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的激活，從而減少細(xì)胞的凋亡?；谝陨涎芯吭O(shè)計并

6、完成了以下實驗。
　　 目的和意義:
　　 探討Ang-(1-7)對IR誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷和致心肌細(xì)胞凋亡作用的影響；以及Ang-(1-7)對IR誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧化應(yīng)激反應(yīng)、心肌細(xì)胞HSP70表達(dá)的影響。通過上述研究有利于深入闡明Ang-(1-7)的心肌細(xì)胞保護(hù)作用及其機(jī)制，為防治心肌缺血再灌注引起心肌損傷提供新的治療靶點，為研制新型的抗心肌缺血再灌注損傷藥物開拓新的思路。
　　 實驗方法:
　　

7、 參照David等人介紹的方法在乳鼠原代心肌細(xì)胞上，建立模擬心肌缺血再灌注損傷模型。應(yīng)用CCK-8試劑盒(日本Dojindo Lab)檢測心肌細(xì)胞存活率；應(yīng)用全自動生化儀測定培養(yǎng)基上清液中乳酸脫氫酶(LDH)水平；Hoechst33258(美國Sigma Aldrich公司)核染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的變化；Fluo-3AM熒光探針熒光顯微鏡照相術(shù)測定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度；DCFH-DA染色熒光顯微鏡照相術(shù)檢測活性氧(reactive o

8、xygen species,ROS)水平；Western blot法檢測心肌細(xì)胞HSP70蛋白表達(dá)。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1、在出生1-3天的SD乳鼠，分離和培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞(功能合體細(xì)胞)。給原代心肌細(xì)胞不同時間缺血(分別為2h、4h、5h、6h、8h)和2h再灌注處理后，細(xì)胞存活率分別降低為95.2±1.3％、66.0±4.2％、52.0±1.9％、38.1±2.3％、27.3±0.7％，經(jīng)相關(guān)性分析r=-0.9

9、8，提示缺血再灌注可以時間依賴性地?fù)p傷乳鼠心肌細(xì)胞。在缺血5h、再灌注2h的實驗組，細(xì)胞的存活率約為50％左右，把這一實驗參數(shù)定為缺血再灌注(IR)的固定損傷因素進(jìn)行下面的實驗。隨著Ang-(1-7)干預(yù)濃度的增大，對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用逐漸體現(xiàn)出來，說明Ang-(1-7)是濃度依賴性的。以10-6mol/L濃度的Ang-(1-7)作為以下檢測預(yù)處理的確定濃度。
　　 2、IR對心肌細(xì)胞有明顯的損傷作用，使乳酸脫氫酶(LDH)釋放

10、增多(140.5±3.6％)，與正常對照組比較，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。10-6mol/LAng-(1-7)本身不影響LDH的基礎(chǔ)釋放，但10-6mol/L Ang-(1-7)預(yù)處理可明顯地對抗IR對心肌細(xì)胞的損傷作用，使LDH釋放降低至(123.2±1.9％)，與IR組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3、Hoechst33258核染色法檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示，IR具有明顯的誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡作用，使

11、心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高(37.1±2.6％)。10-6mol/LAng-(1-7)本身對心肌細(xì)胞的凋亡率無明顯影響，但是，在IR前應(yīng)用10-6mol/L Ang-(1-7)預(yù)處理30min能明顯地抑制IR引起的心肌細(xì)胞凋亡，使心肌細(xì)胞的凋亡率降低至(18.5±1.9)％，與IR組比較，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，結(jié)果提示Ang-(1-7)具有保護(hù)心肌細(xì)胞對抗IR的致凋亡作用。
　　 4、IR能促進(jìn)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣釋放。1

12、0-6mol/LAng-(1-7)本身不影響鈣釋放，但10-6mol/L Ang-(1-7)預(yù)處理能明顯地阻斷IR引起的鈣超載，與IR組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 5、IR誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，使活性氧(ROS)生成明顯增多；10-6mol/LAng-(1-7)本身不影響ROS生成，但10-6mol/LAng-(1-7)預(yù)處理顯著地抑制IR誘導(dǎo)心肌細(xì)胞生成ROS增多，提示Ang-(1-7)具有

13、抗心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)作用。
　　 6.、IR能增加心肌細(xì)胞熱休克蛋白(HSP70)表達(dá)。提示HSP70是心肌細(xì)胞對抗IR損傷的內(nèi)源性防御機(jī)制之一。10-6mol/L Ang-(1-7)本身對心肌細(xì)胞HSP70表達(dá)無明顯影響，但10-6mol/L Ang-(1-7)預(yù)處理在保護(hù)心肌細(xì)胞對抗IR誘導(dǎo)的損傷同時，沒有進(jìn)一步增加IR誘導(dǎo)的HSP70表達(dá)上調(diào)，而且使HSP70表達(dá)明顯減少，與IR組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)

14、，提示這可能與Ang-(1-7)明顯減輕IR對心肌細(xì)胞損傷后，HSP70對IR反應(yīng)減弱有關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1、模擬缺血再灌注對心肌細(xì)胞具有明顯的損傷作用，使細(xì)胞存活率降低，使細(xì)胞凋亡率、LDH釋放、胞內(nèi)鈣釋放及ROS生成均明顯增多，并使HSP70表達(dá)增多。
　　 2、Ang-(1-7)能保護(hù)心肌細(xì)胞對抗IR誘導(dǎo)的損傷，使細(xì)胞存活率升高，使細(xì)胞凋亡率、LDH釋放、胞內(nèi)鈣釋放及ROS生成均明顯減少。Ang-(