基于PoRV VP7與PEDV S基因二聯(lián)DNA疫苗的構(gòu)建及免疫效力評(píng)價(jià).pdf

1、豬輪狀病毒病是由豬輪狀病毒(Porcine Rotavirus，PoRV)引起的一種腹瀉性疾病，主要引起仔豬腹瀉、嘔吐、脫水等。豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種高度接觸性腸道傳染病，主要引起豬群嘔吐、水樣腹瀉和嚴(yán)重脫水等，尤其對(duì)哺乳仔豬有極高致死率。臨床上兩種病毒常混合感染，極大提高仔豬感染后病死率，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前，針對(duì)上述病毒尚無(wú)特效藥

2、治療，為了預(yù)防和控制這些疾病，安全、高效的疫苗研究是首要解決途徑。
　　1、PoRV VP7、PEDV S目的基因的克隆及生物信息學(xué)分析
　　本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Genbank收錄的PoRV OSU代表株(登錄號(hào)KJ450849)和PEDV CV777株(AF353511)全基因分別設(shè)計(jì)1對(duì)引物VP7-a/VP7-b和S-a/S-b。經(jīng)RT-PCR從PoRVSC-R毒株、PEDV SC-P毒株RNA樣品中分別擴(kuò)增出長(zhǎng)度986 bp、9

3、89bp的基因片段。經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化等克隆至PMD19-T(Simple)載體，成功構(gòu)建了PMD-VP7、PMD-S質(zhì)粒，并經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定和測(cè)序鑒定證明克隆片段正確。
　　利用MEGA5.0等軟件分別對(duì)PoRV SC-R株VP7、PEDV SC-P株S基因與Genbank參考序列進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，VP7基因同32株世界各地輪狀病毒參考株同源性為94.9％-98.7％，S基因同38株世界各地參考株同源性為94

4、.7％-98.8％。利用不同生物學(xué)軟件分別對(duì)PoRV VP7、PEDV S目的基因編碼氨基酸進(jìn)行理化性質(zhì)、疏水性、跨膜區(qū)域、信號(hào)肽、抗原決定簇預(yù)測(cè)等分析，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的PoRV VP7、PEDV S目的基因均具有良好的免疫原性。
　　2、聯(lián)合表達(dá)PoRV VP7、PEDV S基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　分別對(duì)PMD-VP7重組質(zhì)粒和pPI-2.EGFP真核表達(dá)載體進(jìn)行EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切反應(yīng)，回收目的片段并經(jīng)連接

5、、轉(zhuǎn)化，成功構(gòu)建了pPI-2.EGFP.VP7重組質(zhì)粒。分別對(duì)PMD-S和pPI-2.EGFP.VP7重組質(zhì)粒進(jìn)行KpnⅠ、BamHⅠ雙酶切，回收目的片段并經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化，成功構(gòu)建了pPI-2.EGFP.VP7.S重組質(zhì)粒，并對(duì)其進(jìn)行酶切鑒定、PCR鑒定和測(cè)序鑒定。
　　3、pPI-2.EGFP.VP7.S重組質(zhì)粒的體外表達(dá)檢測(cè)
　　將pPI-2.EGFP.VP7.S重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞，24 h后可見(jiàn)有綠色熒光蛋白

6、表達(dá)。取轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞抽提總RNA并進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，可分別擴(kuò)增出同VP7、S目的基因及VP7-S融合基因大小相當(dāng)?shù)钠?，表明pPI-2.EGFP.VP7.S轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后成功轉(zhuǎn)錄。取轉(zhuǎn)染后60 h細(xì)胞樣品進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示pPI-2.EGFP.VP7.S在BHK-21細(xì)胞中成功表達(dá)，其表達(dá)蛋白分子量約為98 KDa，且具有良好的反應(yīng)原性。
　　4、pPI-2.EGFP.VP7.S在

7、小鼠體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布及安全性研究
　　將pPI-2.EGFP.VP7.S重組質(zhì)粒以100μg/只肌肉注射小鼠后，采集不同時(shí)期不同組織抽提DNA并進(jìn)行VP7-S融合基因的PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，pPI-2.EGFP.VP7.S核酸疫苗經(jīng)肌肉注射免疫小鼠后3h可到達(dá)心臟、肝臟、肺臟、脾臟、腎臟、腦和血液等部位，在腦部可存留42 d，在心臟、血液中存留63 d以上，在注射部位肌肉可存留91 d以上。此外，對(duì)免疫小鼠不同時(shí)期不同組織進(jìn)行DNA

8、抽提并純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)純化后樣品均未擴(kuò)增出VP7-S條帶，表明pPI-2.EGFP.VP7.S不與宿主染色體DNA整合，從而具有較好的安全性。
　　5、pPI-2.EGFP.VP7.S二聯(lián)核酸疫苗的免疫效果研究
　　將重組質(zhì)粒以不同劑量、不同途徑、不同佐劑免疫小鼠，分別于首免前0d及首免后7d，14 d，21d，28 d，42 d采集血清進(jìn)行PoRV和PEDV抗體IgG檢測(cè);首免后42 d采集血清進(jìn)行細(xì)胞因子IFN-γ、IL-