中國(guó)白兔IL-6基因克隆及對(duì)RHDV VP60基因DNA疫苗免疫佐劑效應(yīng)研究.pdf

1、本研究根據(jù)GenBank上公布的歐洲兔白介素6全基因序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用RT-PCR方法從ConA刺激誘導(dǎo)的中國(guó)白兔外周淋巴細(xì)胞的總RNA中擴(kuò)增出中國(guó)白兔白細(xì)胞介素(IL-6)基因cDNA，并對(duì)其進(jìn)行克隆測(cè)序與分析。結(jié)果表明：成功地克隆出了中國(guó)白兔白IL-6基因，其開(kāi)放閱讀框?yàn)?26 bp，包含241個(gè)氨基酸殘基；與歐洲兔IL-6基因(AF169176)同源性為100％，與GenBank上公布的其他的幾種兔的

2、IL-6基因不完全序列的同源性從84.9-91.1％不等。將所獲得的中國(guó)白兔IL-6基因序列登錄到GenBank上，登錄號(hào)為：EF126499。目前很少有關(guān)兔白細(xì)胞介素的報(bào)道，兔IL-6的克隆在國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。 將中國(guó)白兔IL-6基因亞克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-IL-6。對(duì)其進(jìn)行菌落PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定重組子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：成功地構(gòu)建了中國(guó)白兔IL-6的真核表達(dá)質(zhì)粒。本研究構(gòu)建的p

3、cDNA-IL-6真核表達(dá)質(zhì)粒在國(guó)內(nèi)外尚屬首次，為進(jìn)一步研究中國(guó)白兔IL-6的分子佐劑效應(yīng)提供了基礎(chǔ)材料。將構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-IL-6用脂質(zhì)體包裹，制備成分子佐劑。進(jìn)一步研究中國(guó)白兔IL-6對(duì)疫苗的免疫佐劑效應(yīng)。 本研究將實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的兔出血癥病毒衣殼蛋白VP60基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-VP60通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染真核傳代細(xì)胞Vero細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，用免疫熒光試驗(yàn)觀察真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-VP60在Vero

4、細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果表明：真核重組質(zhì)粒在Vero細(xì)胞中成功地表達(dá)具有免疫原性的VP60蛋白，為進(jìn)一步研究兔出血癥病毒VP60 DNA疫苗提供了科學(xué)依據(jù)。本研究采用大提質(zhì)粒的方法抽提并純化質(zhì)粒pcDNA-VP60，用脂質(zhì)體包裹后制成pcDNA-VP60 DNA疫苗/脂質(zhì)體復(fù)合物，為免疫實(shí)驗(yàn)提供材料。 免疫實(shí)驗(yàn)將25只20日齡，600g-700g的斷奶非免疫健康中國(guó)白兔，隨機(jī)分成5組，1組pcDNA3.1空載體，2組RHD組織滅活

5、苗，3組RHD組織滅活苗+pcDNA-IL-6脂質(zhì)體復(fù)合物，4組pcDNA-VP60-脂質(zhì)體復(fù)合物，5組pcDNA-VP60+ pcDNA-IL-6-脂質(zhì)體復(fù)合物，經(jīng)后腿部?jī)?nèi)側(cè)肌肉多點(diǎn)注射，免疫兩次，兩次免疫間隔時(shí)間為20天。免疫后0d、7d、14d、21d、28d、35d、70d采集血，收集血清，56℃30min滅能后，用血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)血清中特異性抗體的效價(jià)，用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 免疫試驗(yàn)結(jié)果表明：RHD

6、pcDNA-VP60/脂質(zhì)體復(fù)合物與pcDNA-VP60+pcDNA-IL-6-脂質(zhì)體復(fù)合物免疫中，均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，各實(shí)驗(yàn)組與空載體對(duì)照組相比，差異都極顯著p<0.01；但是與組織滅活苗相比差異不顯著p>0.05。核酸疫苗免疫后35天抗體達(dá)到峰值。分子佐劑pcDNA-IL6對(duì)RHD核酸疫苗pcDNA-VP60和組織滅活苗的體液免疫均具有免疫增強(qiáng)作用，在免疫后的7d到70d，無(wú)論是RHD核酸疫苗pcDNA-VP60或是組織滅活

7、苗，與分子佐劑pcDNA-LL6共注射免疫組抗體都高于未加分子佐劑免疫組，差異均顯著p<0.05或極顯著p<0.01。第3組和第5組免疫后產(chǎn)生的特異性抗體滴度明顯高于對(duì)照組，第2組和第3組，差異均顯著p<0.05或極顯著p<0.01。攻毒實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組和第4組保護(hù)率很低，在RHDV強(qiáng)毒的攻擊時(shí)得不到很好的保護(hù)，而在添加有分子佐劑的第5組和第3組，卻得到了很好的保護(hù)。說(shuō)明分子佐劑pcDNA-IL6有促進(jìn)機(jī)體抵抗強(qiáng)毒的攻擊的趨勢(shì)。本研究為RH