固有免疫分子TRIM22對(duì)乙型肝炎病毒的抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是世界性的衛(wèi)生難題，它能引起肝炎、肝硬化、甚至肝癌，嚴(yán)重危害人類健康。迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)有效的治療措施。HBV是很小的包膜病毒，其基因組結(jié)構(gòu)精密，約3，200個(gè)堿基對(duì)(bp)。HBV含有4個(gè)開(kāi)放讀碼框架(ORF)，分別命名為C、S、P、X區(qū)。C區(qū)編碼核心抗原和E抗原：核心抗原是病毒核衣殼的主要組成成份，E抗原則可能在病毒感染過(guò)程中起到免疫調(diào)節(jié)作用。S區(qū)編碼的是表面抗原，可能與病

2、毒粘附到細(xì)胞表面有關(guān)。P區(qū)編碼的是病毒DNA多聚酶，該酶也是一種逆轉(zhuǎn)錄酶。X區(qū)編碼的是一轉(zhuǎn)錄活化子。這些基因的表達(dá)受到四個(gè)啟動(dòng)子的調(diào)控(包括兩個(gè)表面抗原啟動(dòng)子、一個(gè)core啟動(dòng)子和一個(gè)X啟動(dòng)子)。
　　 TRIM22(Tripartite Motif Protein 22)，又名為Staf50(stimulating transacting factor，50 kDa)，是TRIM蛋白家族成員之一。TRIM蛋白也稱為RBCC蛋白

3、，從其蛋白肽鏈的N端到C端依次包括一個(gè)RING結(jié)構(gòu)域，一個(gè)或兩個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和一個(gè)coiled-coil結(jié)構(gòu)域，部分TRIM分子在C末端還有SPRY結(jié)構(gòu)域?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)近70個(gè)TRIM蛋白家族成員，它們與機(jī)體多種生理過(guò)程有關(guān)，如細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、癌變和凋亡等。近年研究發(fā)現(xiàn)，越來(lái)越多的TRIM家族分子(如TRIM5α、TRIM19、TRIM25和TRIM28等)在抗病毒固有免疫中起到重要作用，且許多TRIM家族分子亦可被干擾素(int

4、erferon，IFN)誘導(dǎo)上調(diào)，這提示TRIM家族蛋白可能是一類廣泛存在的新型抗病毒固有免疫分子。
　　 在正常生理情況下，TRIM22主要在外周血單個(gè)核細(xì)胞、淋巴組織以及卵巢中高表達(dá)，有研究表明TRIM22與淋巴細(xì)胞的活化和骨髓紅細(xì)胞的分化有關(guān)。在其他組織器官(包括肝臟)中，TRIM22僅有基礎(chǔ)表達(dá)，但有研究證實(shí)干擾素和p53可在某些細(xì)胞系中明顯上調(diào)TRIM22基因的表達(dá)。TRIM22可抑制HIV-1長(zhǎng)末端重復(fù)序列引發(fā)的轉(zhuǎn)錄

5、，并可在某些細(xì)胞系中抑制HIV-1的復(fù)制，這提示TRIM22具有抗病毒作用，是又一具有抗病毒功能的TRIM蛋白。尤為值得關(guān)注的是：急性HBV感染猩猩的肝臟基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，TRIM22在HBV清除過(guò)程中被誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，是與HBV清除相關(guān)的基因之一，這提示TRIM22在HBV的自然感染過(guò)程中可能發(fā)揮了抗病毒作用，但TRIM22是如何被誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)以及它在HBV清除過(guò)程中所發(fā)揮的作用還不清楚。本課題將研究TRIM22基因的誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制，并

6、通過(guò)體外、體內(nèi)乙肝模型來(lái)研究TRIM22的抗HBV作用以及對(duì)TRIM22分子抗病毒機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 第一部分 干擾素和p53在人肝細(xì)胞中對(duì)TRIM22的誘導(dǎo)表達(dá)
　　 TRIM22在某些細(xì)胞株中是干擾素誘導(dǎo)基因，已知干擾素可以非殺細(xì)胞的方式抑制HBV的基因表達(dá)與復(fù)制，但干擾素的效應(yīng)蛋白及其清除病毒的詳細(xì)分子機(jī)制仍不十分清楚。那么干擾素是否可能通過(guò)上調(diào)TRIM22的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)其抗HBV的作用呢?為研究TRIM22是否可

7、在肝細(xì)胞中被干擾素誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，我們首先利用不同劑量的重組人IFN-α或IFN-γ對(duì)高分化的人肝細(xì)胞系HepG2細(xì)胞刺激相應(yīng)時(shí)間，再通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)干擾素對(duì)TRIM22 mRNA誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞中TRIM22的基礎(chǔ)表達(dá)值低，但可被IFN-α和IFN-γ以劑量依賴的方式明顯上調(diào)表達(dá)，IFN-γ對(duì)TRIM22的誘導(dǎo)表達(dá)能力稍弱于IFN-α；IFN-α表達(dá)的峰值在24 h左右，而IFN-γ對(duì)TRIM22的誘導(dǎo)

8、表達(dá)則呈時(shí)間依賴性。為進(jìn)一步驗(yàn)證該現(xiàn)象，我們利用IFN-α或IFN-γ對(duì)另外一株人肝細(xì)胞系Huh7進(jìn)行刺激，再通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)TRIM22 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFN-α或IFN-γ亦能明顯上調(diào)Huh7細(xì)胞中TRIM22 mRNA的表達(dá)，與HepG2細(xì)胞相類似的是，IFN-γ對(duì)TRIM22的誘導(dǎo)表達(dá)能力稍弱于IFN-α。提示IFN-α或IFN-γ可上調(diào)表達(dá)人肝細(xì)胞系中TRIM22 mRNA的表達(dá)。
　　 為進(jìn)

9、一步研究干擾素是否可在蛋白水平上誘導(dǎo)TRIM22的表達(dá)，我們將TRIM22多肽與鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)，免疫兔制備抗血清；再通過(guò)免疫親和層析法純化出TRIM22多肽特異性抗體。利用該抗體對(duì)IFN-α或IFN-γ處理的與未處理的HepG2細(xì)胞進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)干擾素處理的HepG2細(xì)胞相比較，IFN-α或IFN-γ可明顯上調(diào)HepG2細(xì)胞中TRIM22蛋白水平的表達(dá)。
　　 p53可在某些細(xì)胞株中上調(diào)TRIM2

10、2的表達(dá)，p53亦可有效抑制HBV的轉(zhuǎn)錄復(fù)制。為研究p53是否可在肝細(xì)胞中誘導(dǎo)TRIM22的表達(dá)，我們用紫外線(UV)處理HepG2細(xì)胞以誘導(dǎo)內(nèi)源性p53的表達(dá)，通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)TRIM22的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)UV處理HpG2細(xì)胞后p53基因表達(dá)增加，并明顯上調(diào)了TRIM22的表達(dá)。為進(jìn)一步研究p53是否可直接上調(diào)HepG2細(xì)胞中。TRIM22的表達(dá)，我們將野生型p53真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-p53和pCMV空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG

11、2細(xì)胞，48h后通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)TRIM22的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空質(zhì)粒組相比較，pCMV-p53處理組的TRIM22表達(dá)明顯上調(diào)。提示在內(nèi)源性和外源性p53的刺激下，HepG2細(xì)胞中的TRIM22基因均可明顯上調(diào)表達(dá)。
　　 第二部分 TRIM22對(duì)HBV抑制作用研究
　　 為研究干擾素誘導(dǎo)表達(dá)的、p53靶基因TRIM22是否具有抑制HBV的能力，我們將TRIM22的真核表達(dá)質(zhì)粒與復(fù)制型HBV質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG

12、2細(xì)胞，通過(guò)ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清中的HBsAg和HBeAg含量，Northern blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的HBV轉(zhuǎn)錄本，Southern blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的HBV復(fù)制中間體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRIM22可明顯降低HBsAg和HBeAg的合成。與空質(zhì)粒處理組相比較，轉(zhuǎn)染三天后，TRIM22真核表達(dá)質(zhì)粒處理組的HBsAg約降低了75％，HBeAg約降低了60％。在TRIM22抗HBV的劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TRIM22可以劑量依賴的方式明

13、顯抑制HBV的蛋白合成。Northern blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TRIM22可顯著降低HBV的轉(zhuǎn)錄本水平。Southern blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRIM22可明顯下調(diào)HBV的復(fù)制中間體水平。為排除TRIM22對(duì)HBV的抑制作用是由該基因?qū)?xì)胞的毒性所導(dǎo)致，我們觀察了轉(zhuǎn)染細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)速度，并通過(guò)BCA法檢測(cè)了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的蛋白含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空質(zhì)粒處理組細(xì)胞相比較，TRIM22真核表達(dá)質(zhì)粒處理組細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)速度及總蛋白濃度均沒(méi)有明顯差異。提示T

14、RIM22可在乙肝細(xì)胞模型中有效抑制HBV基因的表達(dá)與復(fù)制。
　　 為進(jìn)一步研究TRIM22是否亦在體內(nèi)具有抗HBV的功能，我們通過(guò)高壓注射法將TRIM22真核表達(dá)質(zhì)粒與復(fù)制型HBV質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Balb/C小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TRIM22可明顯降低小鼠血清中HBsAg和HBeAg的含量。與空質(zhì)粒處理組相比較，轉(zhuǎn)染四天后，TRIM22真核表達(dá)質(zhì)粒處理組小鼠血清中的HBsAg和HbeAg分別降低了65％和55％。免疫組化結(jié)果表明TRIM2

15、2可明顯抑制小鼠肝臟中HBcAg的表達(dá)。Northern blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TRIM22可顯著降低小鼠肝臟中HBV的轉(zhuǎn)錄本水平。為排除TRIM22在小鼠體內(nèi)對(duì)HBV的抑制作用是由于TRIM22對(duì)肝臟的毒性作用所導(dǎo)致，我們檢測(cè)了注射質(zhì)粒后小鼠血清中的ALT含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空質(zhì)粒處理組與TRIM22真核表達(dá)質(zhì)粒處理組小鼠在血清ALT水平上并無(wú)差異。提示TRIM22亦可在小鼠乙肝模型中抑制HBV的基因表達(dá)。
　　 為研究了TRIM22

16、的RING結(jié)構(gòu)域和SPRY結(jié)構(gòu)域在抗HBV的過(guò)程中所起的作用，我們以野生型TRIM22真核表達(dá)質(zhì)粒為模板，采用定點(diǎn)突變技術(shù)將TRIM22 RING結(jié)構(gòu)域第15位半胱氨酸突變成丙氨酸(C15A)，并構(gòu)建了SPRY結(jié)構(gòu)域缺失的TRIM22真核表達(dá)質(zhì)粒。采用磷酸鈣沉淀法將野生型及突變型TRIM22真核表達(dá)質(zhì)粒與復(fù)制型HBV質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，3天后檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)將RING結(jié)構(gòu)域保守的第15位半

17、胱氨酸突變成丙氨酸或?qū)PRY結(jié)構(gòu)域缺失后，TRIM22對(duì)HBV的抑制功能基本消失。為排除TRIM22突變體對(duì)HBV基因表達(dá)抑制能力的下降是由于突變體蛋白表達(dá)水平的下降所致，我們通過(guò)Western blot檢測(cè)了TRIM22野生型和突變體在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的蛋白表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型TRIM22和TRIM22突變體在蛋白水平上的表達(dá)基本一致。提示RING和SPRY結(jié)構(gòu)域?qū)RIM22的抗HBV能力起到關(guān)鍵作用。
　　 第三部分 TRI

18、M22抗HBV的作用機(jī)制
　　 為研究TRIM22是否可抑制HBV啟動(dòng)子的活性，我們構(gòu)建了4個(gè)HBV啟動(dòng)子依賴的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(SpLUC、XpLUC、CpLUC和PS(1)pLUC)。通過(guò)磷酸鈣沉淀法將TRIM22真核表達(dá)質(zhì)粒與4個(gè)HBV啟動(dòng)子依賴的熒光報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，48 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液中的熒光素酶。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TRIM22可下調(diào)HBV四個(gè)啟動(dòng)子的活性，其中S啟動(dòng)子活性約下調(diào)75％，Core啟動(dòng)子活性

19、約下調(diào)65％，pre-S啟動(dòng)子活性約下調(diào)42％，X啟動(dòng)子活性約下調(diào)28％，而TRIM22 RING結(jié)構(gòu)域保守半胱氨酸點(diǎn)突變體和SPRY結(jié)構(gòu)域缺失突變體對(duì)HBV啟動(dòng)子活性的抑制作用基本消失。提示TRIM22可在轉(zhuǎn)錄水平上抑制HBV的基因表達(dá)。
　　 由于以往研究發(fā)現(xiàn)某些細(xì)胞因子，如干擾素、TNFα，亦可抑制HBV啟動(dòng)子的活性，而NF-κB和IFN-β信號(hào)通路的活化對(duì)這些炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生起到至關(guān)重要的作用，為此我們對(duì)TRIM22在

20、HepG2細(xì)胞中對(duì)NF-κB和IFN-β啟動(dòng)子活性的可能影響進(jìn)行了研究。 為研究TRIM22在HepG2細(xì)胞中對(duì)NF-κB啟動(dòng)子活性的影響，我們將TRIM22和RIGI(2CARD)的真核表達(dá)質(zhì)粒分別與NF-κB啟動(dòng)子依賴的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染42 h后在TNF處理組加入TNF-α至終濃度為1000 U/ml，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，收集細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞裂解液中熒光素酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRIM22不能在HepG2細(xì)胞中上調(diào)NF-

21、κB啟動(dòng)子的活性，而TNF-α和RIG I(2CARD)在HepG2細(xì)胞中上調(diào)NF-κB啟動(dòng)子活性的倍數(shù)分別為15.5和2.1倍左右。提示TRIM22不能在HepG2細(xì)胞中有效活化NF-κB信號(hào)通路。
　　 為研究TRIM22在HepG2細(xì)胞中對(duì)IFN-β啟動(dòng)子活性的影響，我們將TRIM22真核表達(dá)質(zhì)粒和RIG I(2CARD)真核表達(dá)質(zhì)粒分別與IFN-β啟動(dòng)子依賴的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞檢

22、測(cè)細(xì)胞裂解液中熒光素酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRIM22不能在HepG2細(xì)胞中上調(diào)IFN-β啟動(dòng)子的活性，而RIG I(2CARD)在HepG2細(xì)胞中上調(diào)IFN-β啟動(dòng)子活性的倍數(shù)為13.5倍左右。提示TRIM22不能在HepG2細(xì)胞中有效活化IFN-β信號(hào)通路。 TRIM分子的細(xì)胞定位與其功能的發(fā)揮密切相關(guān)。為研究TRIM22在HepG2細(xì)胞中的定位，我們通過(guò)磷酸鈣沉淀法將野生型、RING結(jié)構(gòu)域第15位半胱氨酸突變成丙氨酸及SPRY結(jié)構(gòu)域缺失

23、的TRIM22真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后通過(guò)間接免疫熒光法檢測(cè)野生型TRIM22和TRIM22突變體在HepG2細(xì)胞中的定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型和RING結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變的TRIM22蛋白主要定位在細(xì)胞核，而SPRY結(jié)構(gòu)域缺失的TRIM22蛋白則定位在胞漿。提示TRIM22蛋白主要定位在HepG2細(xì)胞核中，而SPRY結(jié)構(gòu)域?qū)RIM22蛋白的細(xì)胞定位起到關(guān)鍵作用。為研究?jī)?nèi)源性TRIM22蛋白在HepG2細(xì)胞中的定位，我們

24、利用TRIM22多肽特異性抗體分別對(duì)HepG2細(xì)胞的胞漿與胞核提取物進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性TRIM22蛋白亦主要定位在核內(nèi)。TRIM22蛋白主要定位在肝細(xì)胞核與其作為轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮抗HBV作用相符。
　　 綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)TRIM22可在人肝細(xì)胞系中被干擾素和p53誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)；TRIM22可在體外細(xì)胞模型和體內(nèi)小鼠模型中抑制HBV基因的表達(dá)與復(fù)制。TRIM22可抑制HBV啟動(dòng)子的活性，細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)TRI