固有免疫分子TRIM22對乙型肝炎病毒的抑制作用及其機制研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是世界性的衛(wèi)生難題，它能引起肝炎、肝硬化、甚至肝癌，嚴重危害人類健康。迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)有效的治療措施。HBV是很小的包膜病毒，其基因組結構精密，約3，200個堿基對(bp)。HBV含有4個開放讀碼框架(ORF)，分別命名為C、S、P、X區(qū)。C區(qū)編碼核心抗原和E抗原：核心抗原是病毒核衣殼的主要組成成份，E抗原則可能在病毒感染過程中起到免疫調節(jié)作用。S區(qū)編碼的是表面抗原，可能與病

2、毒粘附到細胞表面有關。P區(qū)編碼的是病毒DNA多聚酶，該酶也是一種逆轉錄酶。X區(qū)編碼的是一轉錄活化子。這些基因的表達受到四個啟動子的調控(包括兩個表面抗原啟動子、一個core啟動子和一個X啟動子)。
　　 TRIM22(Tripartite Motif Protein 22)，又名為Staf50(stimulating transacting factor，50 kDa)，是TRIM蛋白家族成員之一。TRIM蛋白也稱為RBCC蛋白

3、，從其蛋白肽鏈的N端到C端依次包括一個RING結構域，一個或兩個B-box結構域和一個coiled-coil結構域，部分TRIM分子在C末端還有SPRY結構域?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)近70個TRIM蛋白家族成員，它們與機體多種生理過程有關，如細胞增殖、分化、發(fā)育、癌變和凋亡等。近年研究發(fā)現(xiàn)，越來越多的TRIM家族分子(如TRIM5α、TRIM19、TRIM25和TRIM28等)在抗病毒固有免疫中起到重要作用，且許多TRIM家族分子亦可被干擾素(int

4、erferon，IFN)誘導上調，這提示TRIM家族蛋白可能是一類廣泛存在的新型抗病毒固有免疫分子。
　　 在正常生理情況下，TRIM22主要在外周血單個核細胞、淋巴組織以及卵巢中高表達，有研究表明TRIM22與淋巴細胞的活化和骨髓紅細胞的分化有關。在其他組織器官(包括肝臟)中，TRIM22僅有基礎表達，但有研究證實干擾素和p53可在某些細胞系中明顯上調TRIM22基因的表達。TRIM22可抑制HIV-1長末端重復序列引發(fā)的轉錄

5、，并可在某些細胞系中抑制HIV-1的復制，這提示TRIM22具有抗病毒作用，是又一具有抗病毒功能的TRIM蛋白。尤為值得關注的是：急性HBV感染猩猩的肝臟基因表達譜分析發(fā)現(xiàn)，TRIM22在HBV清除過程中被誘導表達上調，是與HBV清除相關的基因之一，這提示TRIM22在HBV的自然感染過程中可能發(fā)揮了抗病毒作用，但TRIM22是如何被誘導表達上調以及它在HBV清除過程中所發(fā)揮的作用還不清楚。本課題將研究TRIM22基因的誘導表達機制，并

6、通過體外、體內乙肝模型來研究TRIM22的抗HBV作用以及對TRIM22分子抗病毒機制進行探討。
　　 第一部分 干擾素和p53在人肝細胞中對TRIM22的誘導表達
　　 TRIM22在某些細胞株中是干擾素誘導基因，已知干擾素可以非殺細胞的方式抑制HBV的基因表達與復制，但干擾素的效應蛋白及其清除病毒的詳細分子機制仍不十分清楚。那么干擾素是否可能通過上調TRIM22的表達來實現(xiàn)其抗HBV的作用呢?為研究TRIM22是否可

7、在肝細胞中被干擾素誘導上調表達，我們首先利用不同劑量的重組人IFN-α或IFN-γ對高分化的人肝細胞系HepG2細胞刺激相應時間，再通過實時定量RT-PCR技術檢測干擾素對TRIM22 mRNA誘導表達。結果發(fā)現(xiàn)，HepG2細胞中TRIM22的基礎表達值低，但可被IFN-α和IFN-γ以劑量依賴的方式明顯上調表達，IFN-γ對TRIM22的誘導表達能力稍弱于IFN-α；IFN-α表達的峰值在24 h左右，而IFN-γ對TRIM22的誘導

8、表達則呈時間依賴性。為進一步驗證該現(xiàn)象，我們利用IFN-α或IFN-γ對另外一株人肝細胞系Huh7進行刺激，再通過實時定量RT-PCR檢測TRIM22 mRNA的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)IFN-α或IFN-γ亦能明顯上調Huh7細胞中TRIM22 mRNA的表達，與HepG2細胞相類似的是，IFN-γ對TRIM22的誘導表達能力稍弱于IFN-α。提示IFN-α或IFN-γ可上調表達人肝細胞系中TRIM22 mRNA的表達。
　　 為進

9、一步研究干擾素是否可在蛋白水平上誘導TRIM22的表達，我們將TRIM22多肽與鑰孔血藍蛋白(KLH)偶聯(lián)，免疫兔制備抗血清；再通過免疫親和層析法純化出TRIM22多肽特異性抗體。利用該抗體對IFN-α或IFN-γ處理的與未處理的HepG2細胞進行免疫印跡檢測。結果發(fā)現(xiàn)，與未經干擾素處理的HepG2細胞相比較，IFN-α或IFN-γ可明顯上調HepG2細胞中TRIM22蛋白水平的表達。
　　 p53可在某些細胞株中上調TRIM2

10、2的表達，p53亦可有效抑制HBV的轉錄復制。為研究p53是否可在肝細胞中誘導TRIM22的表達，我們用紫外線(UV)處理HepG2細胞以誘導內源性p53的表達，通過實時定量RT-PCR檢測TRIM22的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)UV處理HpG2細胞后p53基因表達增加，并明顯上調了TRIM22的表達。為進一步研究p53是否可直接上調HepG2細胞中。TRIM22的表達，我們將野生型p53真核表達質粒pCMV-p53和pCMV空質粒轉染HepG

11、2細胞，48h后通過實時定量PCR技術檢測TRIM22的表達。結果發(fā)現(xiàn)，與空質粒組相比較，pCMV-p53處理組的TRIM22表達明顯上調。提示在內源性和外源性p53的刺激下，HepG2細胞中的TRIM22基因均可明顯上調表達。
　　 第二部分 TRIM22對HBV抑制作用研究
　　 為研究干擾素誘導表達的、p53靶基因TRIM22是否具有抑制HBV的能力，我們將TRIM22的真核表達質粒與復制型HBV質粒共轉染HepG

12、2細胞，通過ELISA檢測轉染細胞上清中的HBsAg和HBeAg含量，Northern blot檢測轉染細胞中的HBV轉錄本，Southern blot檢測轉染細胞中的HBV復制中間體。結果發(fā)現(xiàn)TRIM22可明顯降低HBsAg和HBeAg的合成。與空質粒處理組相比較，轉染三天后，TRIM22真核表達質粒處理組的HBsAg約降低了75％，HBeAg約降低了60％。在TRIM22抗HBV的劑量效應實驗中發(fā)現(xiàn)，TRIM22可以劑量依賴的方式明

13、顯抑制HBV的蛋白合成。Northern blot結果發(fā)現(xiàn)，TRIM22可顯著降低HBV的轉錄本水平。Southern blot結果發(fā)現(xiàn)TRIM22可明顯下調HBV的復制中間體水平。為排除TRIM22對HBV的抑制作用是由該基因對細胞的毒性所導致，我們觀察了轉染細胞形態(tài)與生長速度，并通過BCA法檢測了轉染細胞的蛋白含量，結果發(fā)現(xiàn)與空質粒處理組細胞相比較，TRIM22真核表達質粒處理組細胞的形態(tài)、生長速度及總蛋白濃度均沒有明顯差異。提示T

14、RIM22可在乙肝細胞模型中有效抑制HBV基因的表達與復制。
　　 為進一步研究TRIM22是否亦在體內具有抗HBV的功能，我們通過高壓注射法將TRIM22真核表達質粒與復制型HBV質粒共轉染Balb/C小鼠。結果發(fā)現(xiàn)，TRIM22可明顯降低小鼠血清中HBsAg和HBeAg的含量。與空質粒處理組相比較，轉染四天后，TRIM22真核表達質粒處理組小鼠血清中的HBsAg和HbeAg分別降低了65％和55％。免疫組化結果表明TRIM2

15、2可明顯抑制小鼠肝臟中HBcAg的表達。Northern blot結果發(fā)現(xiàn)，TRIM22可顯著降低小鼠肝臟中HBV的轉錄本水平。為排除TRIM22在小鼠體內對HBV的抑制作用是由于TRIM22對肝臟的毒性作用所導致，我們檢測了注射質粒后小鼠血清中的ALT含量。結果發(fā)現(xiàn)，空質粒處理組與TRIM22真核表達質粒處理組小鼠在血清ALT水平上并無差異。提示TRIM22亦可在小鼠乙肝模型中抑制HBV的基因表達。
　　 為研究了TRIM22

16、的RING結構域和SPRY結構域在抗HBV的過程中所起的作用，我們以野生型TRIM22真核表達質粒為模板，采用定點突變技術將TRIM22 RING結構域第15位半胱氨酸突變成丙氨酸(C15A)，并構建了SPRY結構域缺失的TRIM22真核表達質粒。采用磷酸鈣沉淀法將野生型及突變型TRIM22真核表達質粒與復制型HBV質粒共轉染HepG2細胞，3天后檢測轉染細胞上清中HBsAg和HBeAg的表達量。結果發(fā)現(xiàn)將RING結構域保守的第15位半

17、胱氨酸突變成丙氨酸或將SPRY結構域缺失后，TRIM22對HBV的抑制功能基本消失。為排除TRIM22突變體對HBV基因表達抑制能力的下降是由于突變體蛋白表達水平的下降所致，我們通過Western blot檢測了TRIM22野生型和突變體在轉染細胞中的蛋白表達量，結果發(fā)現(xiàn)野生型TRIM22和TRIM22突變體在蛋白水平上的表達基本一致。提示RING和SPRY結構域對TRIM22的抗HBV能力起到關鍵作用。
　　 第三部分 TRI

18、M22抗HBV的作用機制
　　 為研究TRIM22是否可抑制HBV啟動子的活性，我們構建了4個HBV啟動子依賴的熒光素酶報告質粒(SpLUC、XpLUC、CpLUC和PS(1)pLUC)。通過磷酸鈣沉淀法將TRIM22真核表達質粒與4個HBV啟動子依賴的熒光報告質粒共轉染入HepG2細胞，48 h后檢測轉染細胞裂解液中的熒光素酶。結果發(fā)現(xiàn)，TRIM22可下調HBV四個啟動子的活性，其中S啟動子活性約下調75％，Core啟動子活性

19、約下調65％，pre-S啟動子活性約下調42％，X啟動子活性約下調28％，而TRIM22 RING結構域保守半胱氨酸點突變體和SPRY結構域缺失突變體對HBV啟動子活性的抑制作用基本消失。提示TRIM22可在轉錄水平上抑制HBV的基因表達。
　　 由于以往研究發(fā)現(xiàn)某些細胞因子，如干擾素、TNFα，亦可抑制HBV啟動子的活性，而NF-κB和IFN-β信號通路的活化對這些炎性細胞因子的產生起到至關重要的作用，為此我們對TRIM22在

20、HepG2細胞中對NF-κB和IFN-β啟動子活性的可能影響進行了研究。 為研究TRIM22在HepG2細胞中對NF-κB啟動子活性的影響，我們將TRIM22和RIGI(2CARD)的真核表達質粒分別與NF-κB啟動子依賴的熒光素酶報告質粒共轉染HepG2細胞，轉染42 h后在TNF處理組加入TNF-α至終濃度為1000 U/ml，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，收集細胞檢測細胞裂解液中熒光素酶活性。結果發(fā)現(xiàn)TRIM22不能在HepG2細胞中上調NF-

21、κB啟動子的活性，而TNF-α和RIG I(2CARD)在HepG2細胞中上調NF-κB啟動子活性的倍數(shù)分別為15.5和2.1倍左右。提示TRIM22不能在HepG2細胞中有效活化NF-κB信號通路。
　　 為研究TRIM22在HepG2細胞中對IFN-β啟動子活性的影響，我們將TRIM22真核表達質粒和RIG I(2CARD)真核表達質粒分別與IFN-β啟動子依賴的熒光素酶報告質粒共轉染HepG2細胞，轉染48 h后收集細胞檢

22、測細胞裂解液中熒光素酶活性。結果發(fā)現(xiàn)TRIM22不能在HepG2細胞中上調IFN-β啟動子的活性，而RIG I(2CARD)在HepG2細胞中上調IFN-β啟動子活性的倍數(shù)為13.5倍左右。提示TRIM22不能在HepG2細胞中有效活化IFN-β信號通路。 TRIM分子的細胞定位與其功能的發(fā)揮密切相關。為研究TRIM22在HepG2細胞中的定位，我們通過磷酸鈣沉淀法將野生型、RING結構域第15位半胱氨酸突變成丙氨酸及SPRY結構域缺失

23、的TRIM22真核表達質粒轉染入HepG2細胞，轉染48 h后通過間接免疫熒光法檢測野生型TRIM22和TRIM22突變體在HepG2細胞中的定位。結果發(fā)現(xiàn)，野生型和RING結構域點突變的TRIM22蛋白主要定位在細胞核，而SPRY結構域缺失的TRIM22蛋白則定位在胞漿。提示TRIM22蛋白主要定位在HepG2細胞核中，而SPRY結構域對TRIM22蛋白的細胞定位起到關鍵作用。為研究內源性TRIM22蛋白在HepG2細胞中的定位，我們

24、利用TRIM22多肽特異性抗體分別對HepG2細胞的胞漿與胞核提取物進行免疫印跡檢測，結果發(fā)現(xiàn)內源性TRIM22蛋白亦主要定位在核內。TRIM22蛋白主要定位在肝細胞核與其作為轉錄抑制因子發(fā)揮抗HBV作用相符。
　　 綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)TRIM22可在人肝細胞系中被干擾素和p53誘導上調表達；TRIM22可在體外細胞模型和體內小鼠模型中抑制HBV基因的表達與復制。TRIM22可抑制HBV啟動子的活性，細胞定位研究發(fā)現(xiàn)TRI