不同CD4+T細(xì)胞亞群對動脈粥樣硬化斑塊易損性和斑塊破裂的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 隨著我國生活水平的日益提高及步入老齡化社會，急性冠狀動脈綜合征(Acute Coronary Syndrome，ACS)的發(fā)生率逐步上升，而動脈粥樣硬化斑塊破裂是導(dǎo)致該病的重要原因。易于發(fā)生破裂的斑塊可稱為易損性斑塊或不穩(wěn)定性斑塊，其特征為大的壞死核心和薄的纖維帽。臨床研究發(fā)現(xiàn)斑塊內(nèi)炎癥是引起斑塊易損的關(guān)鍵因素，斑塊破裂幾乎總是與炎癥共存，免疫細(xì)胞在其中發(fā)揮重要作用，其中CD4+T細(xì)胞在動脈粥樣硬化斑塊易損性中的作

2、用引起了廣泛重視。已知CD4+T細(xì)胞受抗原刺激后在不同的細(xì)胞因子作用下可以分化為不同的亞群，包括傳統(tǒng)的Th1細(xì)胞，Th2細(xì)胞和近年發(fā)現(xiàn)的兩個新的亞群:Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatoryT cells，Treg)。目前，不同CD4+T細(xì)胞亞群在動脈粥樣硬化易損斑塊中的作用尚不明確。
　　 為了探討不同CD4+T細(xì)胞亞群與動脈斑塊易損性的關(guān)系，我們首先利用ApoE-/-小鼠建立了動脈粥樣硬化斑塊破裂模型，然后分析了斑塊

3、破裂誘導(dǎo)前后CD4+T細(xì)胞亞群的改變，并根據(jù)獲得的結(jié)果重點(diǎn)分析了Th17亞群及其效應(yīng)分子IL-17與動脈斑塊易損性的關(guān)系。研究結(jié)果對弄清動脈粥樣硬化斑塊易損性和斑塊破裂的免疫機(jī)制、制定防治動脈粥樣硬化斑塊破裂的方案具有重要的理論價值和潛在的應(yīng)用價值。
　　 本課題包括兩部分內(nèi)容:一、不同CD4+T細(xì)胞亞群對動脈粥樣硬化斑塊易損性和斑塊破裂的影響;二、IL-17對動脈粥樣硬化斑塊易損性和斑塊破裂的作用及機(jī)制研究。
　　 第

4、一部分不同CD4+T細(xì)胞亞群對動脈粥樣硬化斑塊易損性和斑塊破裂的影響
　　 方法：
　　 一、動脈粥樣硬化斑塊破裂小鼠模型的建立
　　 1.動物及處理方案:75只8周齡的雄性ApoE-/-小鼠實(shí)驗(yàn)全程高脂飲食（含0.25％膽固醇和15％脂肪）喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為5組:脂多糖組，應(yīng)激組，脂多糖+應(yīng)激組，脂多糖+應(yīng)激+苯腎上腺素組和對照組。于10周行左側(cè)頸總動脈套管（縮窄性硅膠管）術(shù)以誘發(fā)動脈粥樣硬化。分別于術(shù)后6

5、周（25只）或術(shù)后14周（50只）給予各組不同刺激。脂多糖組于刺激第一、二天給予脂多糖腹腔注射（1mg/kg）;應(yīng)激組于刺激第一、二天給予冰水刺激（每天5-10分鐘）;脂多糖+應(yīng)激組于刺激第一、二天聯(lián)合給予應(yīng)激和脂多糖刺激;脂多糖+應(yīng)激+苯腎上腺素組于刺激第一、二天聯(lián)合給予應(yīng)激和脂多糖刺激，于刺激第三天給予苯腎上腺素腹腔注射（8μg/kg）;對照組只給予生理鹽水。共刺激三天，于刺激第四天處理。
　　 2.超聲影像學(xué)檢測動脈粥樣硬

6、化斑塊破裂。
　　 3.病理學(xué)檢測動脈粥樣硬化斑塊破裂:左側(cè)頸動脈斑塊制備連續(xù)石蠟及冰凍切片，蘇木素-伊紅染色、Masson三染、油紅O染色以及免疫組織化學(xué)染色觀察巨噬細(xì)胞(MOMA-2)、平滑肌肌動蛋白(α-SM-actin)的局部表達(dá)。測量斑塊面積、血管面積和纖維帽厚度;測量膠原、脂質(zhì)、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞免疫組化陽性染色面積，并計算它們占斑塊面積的比例。統(tǒng)計斑塊的破裂率，計算易損指數(shù)。易損指數(shù)=（巨噬細(xì)胞+脂質(zhì)）面積陽性百

7、分比/（平滑肌細(xì)胞+膠原）面積陽性百分比。
　　 二、動脈粥樣硬化斑塊破裂誘導(dǎo)前后不同Th亞群的變化
　　 1.分別取同周齡動脈粥樣硬化穩(wěn)定性斑塊和動脈粥樣硬化破裂斑塊小鼠的脾臟制備脾細(xì)胞懸液，進(jìn)行多種標(biāo)記。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟中Th1，Th17和Treg細(xì)胞的比例變化。
　　 三、動脈粥樣硬化斑塊破裂誘導(dǎo)前后相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的變化。
　　 取穩(wěn)定斑塊和破裂斑塊小鼠的主動脈弓，RT-PC

8、R檢測小鼠動脈粥樣硬化斑塊局部轉(zhuǎn)錄因子(T-bet、RORγt)的表達(dá)情況。
　　 四、動脈粥樣硬化斑塊破裂誘導(dǎo)前血清細(xì)胞因子的變化
　　 取穩(wěn)定斑塊和破裂斑塊小鼠血清，采用ELISA檢測動脈粥樣硬化斑塊破裂誘導(dǎo)前后炎性因子變化(IL-17)
　　 結(jié)果
　　 一、動脈粥樣硬化斑塊破裂小鼠模型的建立
　　 由于目前國際上尚無理想的斑塊破裂的小鼠模型，為了研究不同T細(xì)胞亞群在動脈粥樣硬化易損中的作用

9、，我們在參考已有研究的基礎(chǔ)上，改進(jìn)了建模方法，建立了一種動脈粥樣硬化斑塊破裂小鼠模型。
　　 （一）動脈粥樣硬化易損性斑塊的誘導(dǎo)
　　 我們選用8周齡ApoE敲基因小鼠，高脂飼料喂養(yǎng)兩周后于小鼠左頸總動脈處套管，人工模擬血管狹窄，套管后繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)小鼠6周或14周誘導(dǎo)斑塊的形成。處死小鼠后，取左頸總動脈制備切片，HE染色觀察斑塊大小，油紅O染色觀察脂質(zhì)沉積，Masson三染觀察膠原成分以及免疫組化檢測巨噬細(xì)胞(MOM

10、A-2)、平滑肌細(xì)胞(α-SM-actin)在局部的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)動脈套管后14周與動脈套管后6周相比較，斑塊面積明顯增大(P＜0.01)，脂質(zhì)成分增多，壞死核增大(P＜0.05)，纖維帽厚度明顯變薄(P＜0.05)，平滑肌細(xì)胞減少，膠原含量減少，帽/核比值降低(P＜0.01)。由此可見，隨著周齡增長，動脈套管后14周小鼠斑塊比動脈套管后6周小鼠斑塊更趨近于不穩(wěn)定，提示更易于發(fā)生斑塊破裂。
　　 （二）動脈粥樣硬化斑塊破裂的誘導(dǎo)

11、
　　 小鼠行頸動脈套管6周或14周末隨機(jī)分成5組:對照組、LPS組，冰水刺激組，LPS+冰水刺激組和LPS+冰水刺激+苯腎上腺素組，分別給予不同的刺激誘導(dǎo)斑塊的破裂，刺激過程中觀察小鼠的基本體征，刺激三天后，處死小鼠，分析體重、脂質(zhì)代謝及斑塊破裂情況。
　　 1.不同刺激對小鼠的基本特征和脂質(zhì)代謝的影響
　　 單獨(dú)或聯(lián)合刺激對脂質(zhì)代謝參數(shù)（血總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白）均無明顯影響;然而，L

12、PS+冰水刺激或LPS+冰水刺激+苯腎上腺素處理的小鼠（動脈套管后6周和動脈套管后14周），出現(xiàn)精神不振，少動，進(jìn)食減少，體重較對照組有所下降，但實(shí)驗(yàn)過程中均無小鼠死亡，可見聯(lián)合刺激后小鼠的生理變化與ACS患者的臨床表現(xiàn)相似。
　　 2.不同刺激對動脈粥樣硬化斑塊破裂的誘導(dǎo)
　　 動脈套管后6周LPS+冰水刺激組20％出現(xiàn)斑塊內(nèi)出血，LPS+冰水刺激組+苯腎上腺素組有60％出現(xiàn)斑塊內(nèi)出血，其他組未見斑塊內(nèi)明顯變化。動脈套

13、管后14周小鼠對照組和刺激組均有10-20％的小鼠頸動脈有埋入式斑塊，提示有陳舊性斑塊破裂的跡象。LPS+冰水刺激+苯腎上腺素組有20％出現(xiàn)斑塊破裂伴血栓形成，40％出現(xiàn)斑塊破裂伴出血，10％出現(xiàn)斑塊破裂伴脂核膨出。排除埋入式斑塊，斑塊破裂率為70％。LPS+冰水刺激組出現(xiàn)10％斑塊破裂伴出血，但未發(fā)現(xiàn)血栓形成，其他組未發(fā)現(xiàn)明顯變化。這些結(jié)果指出動脈套管后14周小鼠經(jīng)LPS+冰水+苯腎上腺素聯(lián)合刺激，斑塊破裂率高達(dá)70％，而相同刺激，在

14、動脈套管后6周小鼠，僅有60％出現(xiàn)斑塊內(nèi)出血，未出現(xiàn)斑塊纖維帽斷裂或血栓形成的情況。動脈套管后14周小鼠的斑塊較動脈套管后6周小鼠斑塊更具易損斑塊的特點(diǎn)，說明斑塊破裂除了外源性刺激的觸發(fā)作用外，斑塊自身的易損性也是極為關(guān)鍵的因素之一。
　　 總之，我們在高脂喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，利用ApoE-/-小鼠的頸動脈套置縮窄性套管的方法，誘發(fā)動脈粥樣硬化易損斑塊形成，再通過LPS、冰水刺激和苯腎上腺素聯(lián)合刺激的方法在短時間內(nèi)有效促發(fā)斑塊破裂，且

15、伴發(fā)血栓形成，相似于人類病變，建立了一種高效的動脈粥樣硬化斑塊破裂小鼠模型，為我們進(jìn)一步研究動脈粥樣硬化斑塊破裂的免疫學(xué)機(jī)制提供了重要的動物模型。
　　 二、不同CD4+T細(xì)胞亞群與斑塊破裂的關(guān)系
　　 上述研究說明LPS、冰水刺激和苯腎上腺素聯(lián)合刺激，在套管后6周小鼠主要引起斑塊內(nèi)出血，在套管后14周小鼠可有效促發(fā)斑塊破裂。故我們分別將套管后6周和14周小鼠分成兩組:對照組（給予生理鹽水處理）和干預(yù)組(LPS、冰水和苯

16、腎上腺素聯(lián)合刺激)，然后用流式細(xì)胞術(shù)檢測的不同CD4+亞群的改變，分析了他們與斑塊破裂的關(guān)系。
　　 1.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)與斑塊破裂的關(guān)系
　　 已知調(diào)節(jié)性T細(xì)胞具有抑制動脈粥樣硬化斑塊形成的作用，但在斑塊破裂中的作用尚不清楚。為了研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與動脈粥樣硬化斑塊破裂的關(guān)系，我們采用流式細(xì)胞術(shù)的檢測方法，分別檢測了套管后6周、14周小鼠，對照組和干預(yù)組脾細(xì)胞中Tregs的變化。流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)動脈套管

17、后6周干預(yù)組小鼠CD4+ Foxp3+CD25+T細(xì)胞亞群與對照組小鼠比較明顯降低，然而動脈套管后14周干預(yù)組小鼠CD4+ Foxp3+ CD25+T細(xì)胞亞群明顯高于對照組(p＜0.05)，另外，我們發(fā)現(xiàn)除CD4+ Foxp3+ CD25++T細(xì)胞外，在ApoE-/-小鼠的脾臟尚有一群CD4+ Foxp3+ CD25-T細(xì)胞，這群細(xì)胞無論在動脈套管后6周或動脈套管后14周的干預(yù)組均明顯高于對照組(P＜0.05)，說明這兩群調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞

18、群在動脈粥樣硬化斑塊破裂的過程中可能扮演著不同的角色。
　　 2.Th1細(xì)胞與斑塊破裂的關(guān)系
　　 已知Th1具有促進(jìn)斑塊形成、增加斑塊易損性的作用。為了研究Th1細(xì)胞與動脈粥樣硬化斑塊破裂的關(guān)系，我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了外周Th1細(xì)胞的變化。我們發(fā)現(xiàn)在僅有斑塊內(nèi)出血時（動脈套管后6周）小鼠脾細(xì)胞中Th1(CD4+IFN-γ+T)細(xì)胞的數(shù)量在干預(yù)組與對照組間無明顯差異;然而，在有明顯斑塊破裂時（動脈套管后14周）小鼠脾細(xì)

19、胞中Th1（CD4+IFN-γ+T）細(xì)胞的數(shù)量較對照組明顯升高，P＜0.05。這一結(jié)果提示在本實(shí)驗(yàn)的模型中Th1細(xì)胞在斑塊破裂中發(fā)揮一定的作用。
　　 3.Th17細(xì)胞與斑塊破裂的關(guān)系
　　 近兩年，我們和其他學(xué)者的研究顯示Th17具有促進(jìn)斑塊形成的作用，但在斑塊破裂中的作用尚不清楚。因此，我們在檢測Th1變化的同時，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了脾臟中Th17細(xì)胞的改變，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示我們發(fā)現(xiàn)在僅有斑塊內(nèi)出血時（動脈套管

20、后6周）小鼠脾細(xì)胞中Th17(CD4+IL-17+T)細(xì)胞的數(shù)量在干預(yù)組明顯高于對照組（P＜0.05);在有明顯斑塊破裂時（動脈套管后14周）這種差異更加明顯(P＜0.001)，提示我們Th17細(xì)胞與動脈粥樣斑塊易損性和斑塊破裂密切相關(guān)。
　　 4.IL-17+IFN-γ+ CD4+T細(xì)胞與斑塊破裂的關(guān)系
　　 除了Th1(CD4+IFN-γ+T)和Th17(CD4+IL-17+T)，我們還發(fā)現(xiàn)了一群共表達(dá)IL-17和I

21、FN-γ的CD4+T細(xì)胞亞群(CD4+IL-17+IFN-γ+T)。統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)動脈套管后6周和動脈套管后14周干預(yù)組均明顯高于對照組，P＜0.01。提示我們CD4+IL-17+IFN-γ+T細(xì)胞在小鼠動脈粥樣硬化斑塊易損性和斑塊破裂中起著一定的促進(jìn)作用。
　　 5.Th1+Th17/Treg、 Th1/Treg和Th17/Treg和比例與斑塊破裂的關(guān)系
　　 已知CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞具有抑制動脈粥

22、樣硬化斑塊形成的作用，Th1和Th17這些效應(yīng)細(xì)胞主要是促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊的形成，他們的平衡有可能決定斑塊的穩(wěn)定性，所以我們進(jìn)一步分析了Th1+Th17/Treg、Th1/Treg和Th17/Treg比例與斑塊破裂的關(guān)系，試圖尋找在斑塊破裂中起關(guān)鍵作用的T細(xì)胞亞群。我們發(fā)現(xiàn)Th1+Th17/Treg的比例在動脈套管后6周和動脈套管后14周干預(yù)組均高于對照組，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這種比例的失調(diào)主要是由于Th17的變化引起的(P＜0.01)，與Th

23、1的關(guān)系不大(p＞0.05).提示Th17在小鼠動脈粥樣硬化斑塊破裂中發(fā)揮著更重要的作用。
　　 6.Th17的主要效應(yīng)分子IL-17與動脈粥樣硬化斑塊破裂
　　 上述結(jié)果提示Th17在斑塊破裂中發(fā)揮更重要的作用，所以我們又采用ELISA方法檢測血清中Th17的主要效應(yīng)分子IL-17的水平，發(fā)現(xiàn)動脈套管后14周干預(yù)組小鼠較對照組小鼠血清中IL-17的水平明顯升高(P＜0.001)，而動脈套管后6周干預(yù)組與對照組比較無明顯

24、差異，提示我們IL-17在小鼠動脈粥樣硬化斑塊破裂中也起著重要的作用。免疫組織細(xì)胞化學(xué)的染色顯示在斑塊破裂處有高水平IL-17的存在，提示斑塊局部的IL-17可能直接參與了斑塊的破裂。
　　 7.Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt與動脈粥樣硬化斑塊破裂
　　 為了弄清Th17在動脈粥樣硬化斑塊破裂中的作用，我們用RT-PCR的方法檢測動脈粥樣硬化斑塊局部的Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)并同時比較了Th1轉(zhuǎn)錄因子T-

25、bet的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RORγt干預(yù)組斑塊中的表達(dá)明顯高于對照組，其表達(dá)水平明顯高于T-bet，從另一個側(cè)面說明Th17在動脈粥樣硬化斑塊的破裂發(fā)揮更重要的作用。
　　 總之，結(jié)果說明Th17/IL-17可能在促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊易損性中發(fā)揮更為重要的作用，為我們研究動脈粥樣硬化斑塊破裂的免疫學(xué)機(jī)制開辟了新的研究方向。
　　 第二部分IT-17在動脈粥樣硬化斑塊易損性和斑塊破裂中的作用及機(jī)制研究
　　 方法：

26、
　　 一、 Th17/IL-17對動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響
　　 1.ApoE-/-小鼠30只，于8周給予高脂飼料喂養(yǎng)，10周行左側(cè)頸動脈套管縮窄手術(shù)。于動脈套管后8周給ApoE-/-、鼠腹腔注射IL-17（1ug/只，每周1次），對照組同時腹腔注射生理鹽水。分別注射2周，4周，6周。
　　 2.取小鼠左側(cè)頸動脈斑塊及主動脈根部制備連續(xù)石蠟及冰凍切片，蘇木素-伊紅染色、油紅O染色以及免疫組織化學(xué)染色觀察巨噬

27、細(xì)胞(MOMA-2)、平滑肌肌動蛋白(α-SM-actin)的局部表達(dá)。測量斑塊面積、血管面積和纖維帽厚度;測量膠原、脂質(zhì)、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞免疫組化陽性染色面積，并計算它們占斑塊面積的比例。計算易損指數(shù)。
　　 二、 IL-17干預(yù)后不同Th亞群的變化
　　 1.ApoE-/-小鼠30只，于8周給予高脂飼料喂養(yǎng)，10周行左側(cè)頸動脈套管縮窄手術(shù)。于動脈套管后8周給ApoE-/-小鼠腹腔注射IL-17（1ug/只），對照

28、組同時腹腔注射生理鹽水。分別注射2周，4周，6周。
　　 2.分別取不同組小鼠的脾臟制備脾細(xì)胞懸液，進(jìn)行多種標(biāo)記。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟中Th1，Th17和Treg細(xì)胞的比例變化。
　　 三、IL-17體外干預(yù)
　　 1.體外培養(yǎng)小鼠平滑肌細(xì)胞系Movas，分別給予不同濃度的IL-17(25ug/ml，50ug/ml，100 ug/ml)刺激不同時間（24、48、72小時）。
　　 2

29、.Hochest檢測刺激后細(xì)胞的凋亡率。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測刺激后細(xì)胞的凋亡率AnnexinV/PI。
　　 4.應(yīng)用Westem blot方法檢測刺激后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3活性變化。
　　 結(jié)果：
　　 一、外源性IL-17對動脈粥樣硬化斑塊易損性的影響
　　 為了進(jìn)一步證實(shí)Th17/IL-17在動脈粥樣硬化斑塊易損性和斑塊破裂中的作用，我們于頸動脈套管后8周開始給予ApoE

30、-/-小鼠腹腔注射IL-17，分別于治療后2周、4周及6周處死小鼠，取外周血檢測對脂質(zhì)代謝的影響，取左頸總動脈制作切片，HE染色觀察斑塊大小，油紅O染色觀察脂質(zhì)沉積以及免疫組化染色檢測巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞在斑塊局部的表達(dá)。結(jié)果顯示整個治療過程小鼠一般狀況良好，進(jìn)食、活動和精神狀態(tài)未見異常，體重及血脂與對照組未見明顯變化。IL-17治療2周后，小鼠頸動脈的斑塊大小、纖維帽、脂核面積及纖維帽與壞死核比值與對照組比較均無明顯改變; IL-17

31、治療后4周，斑塊面積較對照組增大、纖維帽變薄，盡管脂核面積無明顯差異，但帽/核比值明顯降低(P＜0.05);IL-17治療6周斑塊大小與對照組比較沒有明顯改變，但纖維帽面積減低，脂核明顯增大(P＜0.05)，帽/核比值顯著降低(P＜0.01)，指出外源性IL-17治療可明顯增加斑塊的易損性。
　　 二、外源性IL-17干預(yù)后對小鼠動脈粥樣硬化斑塊破裂的影響
　　 外源性IL-17干預(yù)2周，治療組和對照組未見明顯斑塊破裂;

32、干預(yù)4周組，5只治療組小鼠2例斑塊內(nèi)出現(xiàn)埋入式纖維帽斑塊，對照組沒有破裂的指證;5只干預(yù)6周組小鼠有1例斑塊內(nèi)出血、有3例出現(xiàn)斑塊內(nèi)埋入式纖維帽，但同齡對照組小鼠僅有1只出現(xiàn)斑塊內(nèi)埋入式纖維帽，由于斑塊內(nèi)埋入式纖維帽是斑塊破裂后修復(fù)后的指證，所以這些結(jié)果證明了外源性IL-17干預(yù)不僅可增加動脈粥樣硬化斑塊易損斑塊形成并可誘導(dǎo)斑塊破裂。
　　 三、外源性IL-17干預(yù)不同時間后對外周CD4+T細(xì)胞亞群的影響
　　 為了進(jìn)一

33、步明確外源性IL-17治療對免疫反應(yīng)的影響，我們又分別分析了外源性IL-17干預(yù)后，系統(tǒng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、Th1和Th17細(xì)胞的變化。
　　 1.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)在IL-17干預(yù)后的比例變化
　　 為了研究外源性IL-17對Tregs的影響，我們采用流式細(xì)胞術(shù)的檢測方法，檢測了注射IL-172周、4周及6周組和對照組小鼠脾細(xì)胞中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-17治療2周、4周和6周顯著降低系統(tǒng)性CD4+ Fox

34、p3+ CD25+T細(xì)胞亞群的比列，而上調(diào)CD4+ Foxp3+ CD25-T細(xì)胞亞群的比例變化(P＜0.05)，提示IL-17不僅可直接促進(jìn)斑塊易損性而且可通過改變Treg數(shù)量間接發(fā)揮作用。
　　 2.Th1細(xì)胞在IL-17干預(yù)后的比例變化
　　 結(jié)果顯示注射IL-17后2周和4周組Th1變化沒有明顯統(tǒng)計學(xué)意義，而注射IL-176周組Th1明顯減少，這些結(jié)果和以前在其他模型方發(fā)現(xiàn)IL-17可抑制Th1產(chǎn)生的結(jié)果吻合，這

35、也從另一個方面說明IL-17的增強(qiáng)的斑塊易損性和斑塊破裂和Th1沒有關(guān)系。
　　 3.Th17細(xì)胞在IL-17干預(yù)后的比例變化
　　 我們發(fā)現(xiàn)治療2周、4周和6周小鼠脾臟Th17細(xì)胞的比例均較對照組均明顯升高（P＜0.01）。我們前期研究顯示IL-17可活化巨噬細(xì)胞分泌高水平的IL-6，大量的研究已經(jīng)證明在TGF-β和IL-6的存在下，Th細(xì)胞優(yōu)先向Th17分化，可見外源性IL-17不僅可直接促進(jìn)斑塊易損性而且可通過上調(diào)

36、促進(jìn)Th17細(xì)胞分化進(jìn)一步促進(jìn)斑塊易損性的作用和斑塊的破裂。
　　 4.Th1+Th17/Treg、Th1/Treg、Th17/Treg比例在IL-17干預(yù)后的變化
　　 進(jìn)一步我們分析了IL-17干預(yù)對Th1+Th17/Treg(CD4+CD25+Foxp3+T)、Th1/Treg、Th17/Treg比例的影響，統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-17治療2周、4周、6周均明顯升高了Th17/Treg比例(P＜0.01)，而對Th1/T

37、reg比列的影響不大，上述結(jié)果說明外源性IL-17干預(yù)后主要是通過上調(diào)Th17和下調(diào)Treg(CD4+CD25+Foxp3+T)，進(jìn)而改變Th17/Treg平衡，Th17/Treg的失衡促進(jìn)了動脈粥樣硬化斑塊易損性，加速了斑塊的破裂。
　　 四、外源性IL-17體外處理可以增強(qiáng)平滑肌細(xì)胞的凋亡
　　 已知斑塊纖維帽平滑肌的凋亡，是動脈硬化斑塊易損性和破裂的重要機(jī)制之一，為了進(jìn)一步明確IL-17促進(jìn)斑塊易損性的機(jī)制，我們采

38、用體外培養(yǎng)Movas細(xì)胞，給予不同濃度IL-17培養(yǎng)24，48及72小時，采用Hochest染色在熒光顯微鏡下觀察了凋亡小體的產(chǎn)生，AnnexinV/PI染色用流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率，采用WesternBlot的方法檢測的凋亡相關(guān)分子Caspase3的表達(dá)。三種方法均顯示IL-17在體外能夠促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的凋亡，這種作用具有時間和濃度依賴性。
　　 結(jié)論:
　　 1.建立了小鼠動脈粥樣硬化斑塊破裂模型，為研究斑塊破裂提供了

39、模型
　　 在高脂喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，利用在ApoE-/-小鼠的頸動脈套置縮窄性套管的方法，誘發(fā)動脈粥樣硬化斑塊形成，再通過LPS、冰水刺激和苯腎上腺素聯(lián)合作用的方法在短時間內(nèi)促進(jìn)斑塊發(fā)生破裂，具有高效、易于掌握斑塊破裂的時間點(diǎn)并伴發(fā)血栓形成等特點(diǎn)，相似于人類病變。
　　 2.發(fā)現(xiàn)多種CD4+T細(xì)胞亞群參與動脈粥樣硬化斑塊破裂，其中Th17及其主要效應(yīng)分子IL-17可能更為重要
　　 我們發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化斑塊破裂破裂時

40、，Treg、Th1和Th17均發(fā)生改變，但Th17和Th17/Treg比列的改變更加明顯，斑塊破裂時循環(huán)IL-17升高，斑塊局部有高水平IL-17的表達(dá)，提示Th17和其主要效應(yīng)分子IL-17在動脈粥樣硬化斑塊破裂中發(fā)揮著更為重要的作用。
　　 3.Th17的主要效應(yīng)分子IL-17具有促進(jìn)斑塊易損性和斑塊破裂的作用
　　 外源給予Th17的主要效應(yīng)分子IL-17可以有效降低動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性和促進(jìn)斑塊破裂，證明Th

41、17/IL-17具有促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊易損性的作用，
　　 4.IL-17誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞凋亡是IL-17促進(jìn)斑塊易損性的機(jī)制之一
　　 體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)IL-17可以導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞凋亡增加，說明IL-17促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊易損性增加可以通過促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的凋亡來實(shí)現(xiàn)的。
　　 5.IL-17治療導(dǎo)致的Th17/Treg失衡可能是IL-17增加斑塊的易損性的另一機(jī)制
　　 我們發(fā)現(xiàn)外源性IL-17干預(yù)后可通

42、過上調(diào)Th17和下調(diào)Treg，進(jìn)而改變Th17/Treg平衡，故提示IL-17治療引起Th17/Treg的失衡可能是其促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊易損性、加速斑塊破裂的另一個機(jī)制。
　　 創(chuàng)新性和意義
　　 1.建立了一種新的動脈粥樣硬化斑塊破裂小鼠模型，為研究動脈粥樣硬化斑塊破裂的機(jī)制和探索干預(yù)方法提供了新的手段
　　 由于目前國際上尚無理想的斑塊破裂的小鼠模型，為了研究不同T細(xì)胞亞群在動脈粥樣硬化易損中的作用，我們在

43、參考已有研究的基礎(chǔ)上，改進(jìn)了建模方法，建立了一種動脈粥樣硬化斑塊破裂小鼠模型，該模型具有高效、易于掌握斑塊破裂的時間點(diǎn)的特點(diǎn)，并伴發(fā)血栓形成，相似于人類病變，為研究動脈粥樣硬化斑塊破裂的機(jī)制和探索干預(yù)方法提供了新的模型。
　　 2.發(fā)現(xiàn)Th17在動脈粥樣硬化斑塊破裂中發(fā)揮更為重要的作用，證明外源性IL-17具有增加斑塊易損性、促進(jìn)斑塊破裂的作用，為動脈粥樣硬化斑塊破裂的治療提供了新的靶點(diǎn)。
　　 近兩年，我們和其他學(xué)者的

44、研究顯示Th17具有促進(jìn)斑塊形成的作用，但在斑塊破裂中的作用尚不清楚。本研究在斑塊破裂模型中發(fā)現(xiàn)盡管Treg、 Th1參與斑塊破裂的發(fā)生，但Th17及其主要效應(yīng)分子發(fā)揮更重要的作用;進(jìn)一步通過外源性IL-17治療確定IL-17具有促進(jìn)動脈粥樣硬化易損性和斑塊破裂的作用，為動脈粥樣硬化斑塊破裂的治療提供了新的靶點(diǎn)。
　　 3.發(fā)現(xiàn)IL-17不僅可直接誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞凋亡而且可通過影響Th17/Treg平衡促進(jìn)斑塊的破裂，為揭示IL-