調(diào)節(jié)性T細胞穩(wěn)定動脈粥樣硬化易損斑塊的實驗研究.pdf

1、第一部分：調(diào)節(jié)性T細胞穩(wěn)定動脈粥樣硬化易損斑塊的實驗研究
　　 1、背景：
　　 動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是多因素參與的復(fù)雜病理過程，近年來研究表明免疫反應(yīng)，包括天然免疫和獲得性的免疫機制在AS形成和發(fā)展過程發(fā)揮了重要作用。但是其具體的作用機制并未得到完全的闡述。易損斑塊是指易于形成血栓或可能迅速進展為罪犯病變的斑塊，特點為具有較薄的纖維帽、較大的脂核（占斑塊體積的40％以上）、平滑肌細胞密度

2、低、膠原含量少、活化巨噬細胞和T淋巴細胞浸潤增加，細胞因子合成和釋放增加，部分斑塊內(nèi)部伴有明顯的新生血管生成或斑塊內(nèi)出血的特點。
　　 調(diào)節(jié)性T細胞(CD4+CD25+regulatoryTcells，Tregs)作為特殊類型的CD4+T細胞亞群，是免疫系統(tǒng)的重要組成部分。Tregs參與機體自身的免疫耐受調(diào)節(jié)，終止活化的免疫反應(yīng)，在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)平衡、維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及控制自身免疫性疾病的進展中發(fā)揮了重要作用。Tregs數(shù)量

3、的缺失或功能的失活將會破壞機體免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，導(dǎo)致自身免疫和炎癥反應(yīng)的無限放大。
　　 Tregs在AS過程中的作用已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注。新的證據(jù)表明在ApoE-/-小鼠中給予Tregs治療可阻止早期AS的形成，但其具體的機制尚未闡明。對于大多數(shù)急性心血管事件來說，易損斑塊的穩(wěn)定性是決定因素。到目前為止，Tregs是否影響易損斑塊的穩(wěn)定性尚未報道。
　　 2、目的：
　　 (1)體內(nèi)試驗中，觀察Tregs對易

4、損斑塊破裂率的影響和斑塊內(nèi)成分的改變。
　　 (2)體外試驗中，探討Tregs穩(wěn)定易損斑塊的分子機制。
　　 3、方法：
　　 3.1、Tregs的分選
　　 分離8周齡雄性C57BL/6J小鼠脾細胞，利用磁珠分選技術(shù)獲得純化的Tregs。純化的Tregs按要求分別溶于200μlPBS中，以備下一步操作。
　　 3.2、動物模型的建立
　　 8周齡雄性ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)2周后，右側(cè)

5、頸總動脈套管誘導(dǎo)AS斑塊形成。頸動脈套管手術(shù)8周后，將ApoE-/-小鼠隨機分為5組:A:Control組（無任何干預(yù)）;B:PBS組（尾靜脈注射200μlPBS）;C:小劑量Tregs干預(yù)組（small-doseTregs組，SD組，尾靜脈注射105Tregs）;D:中劑量Tregs干預(yù)組(moderate-doseTregs組，MD組，尾靜脈注射3×105Tregs);E:大劑量Tregs干預(yù)組（large-doseTregs組，L

6、D組，尾靜脈注射106Tregs）。兩周后重復(fù)上述操作一次。Tregs第一次注射第二天，將所有ApoE-/-實驗小鼠置于容積為50ml大小、帶通氣孔的塑料管中（確保足夠的通氣和聲音傳播），同時進行噪音刺激。噪音刺激強度為110dB，噪音每次持續(xù)3秒，間隔為5分鐘。每天持續(xù)6小時，總共四周時間。實驗第14周末，ApoE-/-小鼠被處以安樂死。
　　 3.3、體重、血脂和血壓的測量
　　 實驗的0周和14周末，分別測量每組A

7、poE-/-小鼠的體重。14周末，測量ApoE-/-小鼠的尾動脈血壓，同時收集小鼠血清，檢測總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的水平。
　　 3.4、組織病理學(xué)的檢測
　　 制備右側(cè)頸動脈切片，對頸動脈斑塊進行H&E、天狼猩紅和油紅O染色，觀察斑塊的破裂率，并應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測頸動脈斑塊內(nèi)MOMA-2、SMCs、MCP-1、TNF-α、IL-6、

8、MMP-2、MMP-9和IL-17的表達，計算易損指數(shù)。
　　 3.5、細胞共培養(yǎng)
　　 首先利用磁珠分選將Tregs和CD4+CD25-T細胞從健康人群外周血單核細胞中游離。人血管平滑肌細胞隨機分為5組:Control組（未做任何處理）;CD25-組（細胞培養(yǎng)基中加入5×105CD4+CD25-T細胞）;Tregs組（細胞培養(yǎng)基中分別加入1.25×105，2.5×105和5×105Tregs）。在anti-CD3ant

9、ibody（50ng/ml）存在的情況下培養(yǎng)40小時后，加入TNF-α（100ng/ml）繼續(xù)刺激8小時。在另一組試驗中，anti-TGF-β或anti-IL-10在Tregs和平滑肌細胞共培養(yǎng)前分別加入。
　　 3.6、RT-PCR
　　 收集右側(cè)頸頸動脈組織或各組平滑肌細胞，提取RNA，檢測頸動脈內(nèi)Foxp3、TGF-β、IL-10、MMP-2、MMP-9以及平滑肌細胞內(nèi)P4Hα1、MCP-1、VCAM-1、ICAM

10、-1、MMP-2、MMP-9mRNA的表達。
　　 3.7、Westernblot
　　 收集右側(cè)頸頸動脈組織或各組平滑肌細胞，提取蛋白，檢測頸動脈內(nèi)Foxp3、TGF-β、IL-10、MMP-2、MMP-9、P4Hα1以及平滑肌細胞內(nèi)P4Hα1、MMP-2、MMP-9、JNK、ASK1蛋白的表達。
　　 3.8、ELISA檢測
　　 收集各組細胞上清，檢測細胞上清中Ⅰ、Ⅲ膠原、TGF-β和IL-10的水

11、平濃度。
　　 4、結(jié)果：
　　 4.1、動物一般情況
　　 5組ApoE-/-小鼠體重、血壓以及血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的水平濃度無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 4.2、Tregs阻止斑塊的破裂
　　 對照組50％(8/16例)，PBS組50％(8/16例)，SD組43.8％(7/16例)，MD組12.5％(2/16例)和LD組12.5％(2/16例)的AS斑塊發(fā)生了破裂。MD組和LD組

12、斑塊破裂率明顯低于對照組、PBS組和SD組。
　　 4.3、Tregs對斑塊成分的影響
　　 MD組和LD組頸動脈斑塊內(nèi)巨噬細胞含量、脂質(zhì)含量和易損指數(shù)明顯低于對照組、PBS組和SD組;而平滑肌細胞和膠原的含量則明顯高于對照組、PBS組和SD組。
　　 4.4、Tregs降低炎癥因子的表達
　　 體內(nèi)試驗中，MD組和LD組頸動脈斑塊內(nèi)MCP-1、TNF-α、IL-6和IL-17的表達明顯低于對照組、PBS

13、組和SD組。體外實驗中，不同劑量的Tregs組MCP-1，VCAM-1和ICAM-1mRNA的表達均明顯低于對照組和CD25-組。
　　 4.5、Tregs降低MMP-2和MMP-9的表達
　　 體內(nèi)試驗中，MD組和LD組頸動脈斑塊內(nèi)MMP-2和MMP-9的mRNA表達水平明顯低于對照組、PBS組和SD組。免疫組化和westernblot的對MMP-2和MMP-9蛋白的檢測也證明了相同的趨勢。體外實驗中，Tregs組MM

14、P-2和MMP-9mRNA和蛋白的表達均明顯低于對照組和CD25-組。
　　 4.6、Tregs對P4Hα1表達和ASK1-JNK通路的影響
　　 體內(nèi)試驗中，westernblot檢測發(fā)現(xiàn)MD組和LD組頸動脈斑塊內(nèi)P4Hα1蛋白表達的水平明顯高于對照組、PBS組和SD組。體外試驗中，Tregs組P4Hα1mRNA和蛋白的水平明顯高于對照組和CD25-組。ELISA證實Tregs組細胞上清中Ⅰ型和Ⅲ型膠原的水平濃度較對照

15、組和CD25-組明顯升高。Tregs和平滑肌細胞共培養(yǎng)后，可部分的消除TNF-α對ASK1-JNK的激活作用。從而證實了Tregs通過抑制ASK1-JNK通路而促進P4Hα1的表達。
　　 4.7、Tregs促進TGF-β和IL-10的表達
　　 體內(nèi)試驗中，MD組和LD組頸動脈斑塊內(nèi)TGF-β和IL-10的mRNA和蛋白的水平明顯高于對照組、PBS組和SD組。體外試驗中，收集各組細胞上清利用ELISA檢測TGF-β和I

16、L-10的水平，發(fā)現(xiàn)Tregs組TGF-β和IL-10的濃度明顯高于對照組和CD25-組。
　　 4.8、TGF-β或IL-10介導(dǎo)Tregs對P4Hα1和炎癥因子的作用
　　 為進一步驗證Tregs對炎癥因子、MMP-2、MMP-9和P4Hα1的作用是否通過分泌TGF-β和IL-10而發(fā)揮的，我們預(yù)先將TGF-β或IL-10的中和抗體加入細胞培養(yǎng)基中。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)TGF-β和IL-10中和抗體部分抵消了Treg

17、s對MCP-1、VCAM-1和ICAM-1mRNA的抑制作用。MMP-2和MMP-9mRNA和蛋白的表達在TGF-β和IL-10中和抗體加入后也明顯升高。相反，加入中和抗體后，P4Hα1的mRNA和蛋白的表達則明顯的降低。證明了Tregs部分是通過產(chǎn)生TGF-β和IL-10而介導(dǎo)對炎癥因子、MMP-2、MMP-9和P4Hα1的作用。
　　 5、結(jié)論：
　　 (1)在ApoE-/-小鼠易損斑塊模型中，Tregs可劑量依賴性

18、地穩(wěn)定易損斑塊，降低斑塊的破裂率。
　　 (2)Tregs穩(wěn)定AS易損斑塊的機制為抑制或減輕機體局部炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子和MMP-2、MMP-9的釋放，促進抗炎因子分泌，提高P4Hα1的水平和抑制ASK1-JNK的信號通路。
　　 (3)Tregs的作用部分依賴于本身分泌的TGF-β和IL-10。
　　 第二部分，他汀對易損斑塊中調(diào)節(jié)性T細胞影響的研究
　　 1、背景：
　　 動脈粥樣硬化(at

19、herosclerosis，AS)被認(rèn)為是一種炎癥性疾病，炎癥在AS的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。而炎癥反應(yīng)與免疫反應(yīng)兩者密切相關(guān)，許多重要的免疫因子可誘導(dǎo)和調(diào)控炎癥反應(yīng)，而包括單核巨噬細胞、T淋巴細胞和中性粒細胞在內(nèi)的許多炎癥細胞也具有重要的免疫功能。而在包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、全身性硬化癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病中均發(fā)現(xiàn)了AS加速的過程。
　　 他汀類藥物除具有強有力降脂作用外，還包括改善內(nèi)皮功能、抗炎、抗氧化等

20、，可阻止AS的形成和促進AS易損斑塊的穩(wěn)定。此外，他汀類具有免疫調(diào)節(jié)的特性，抑制IFN-γ誘導(dǎo)的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)Ⅱ類抗原的表達和效應(yīng)性T細胞的活化，而且研究認(rèn)為他汀類藥物穩(wěn)定AS的作用部分的依賴于他們的免疫調(diào)節(jié)機制。
　　 調(diào)節(jié)性T細胞(CD4+CD25+regulatoryTcells，Tregs)是特殊的CD4+T細胞亞群，我們前文的研究發(fā)現(xiàn)Tregs具有抑制炎癥細胞浸潤和炎癥因子釋放，減輕炎癥反應(yīng)的特性。到目

21、前為止，他汀類藥物的治療是否可以影響斑塊內(nèi)Tregs數(shù)量并未有相關(guān)報道。
　　 2、目的：
　　 (1)觀察他汀類藥物治療對AS斑塊內(nèi)的Tregs數(shù)量的影響。
　　 (2)觀察他汀類藥物對ACS患者外周血中Tregs數(shù)量和功能的影響。
　　 3、方法：
　　 3.1、動物模型的建立
　　 40只10周齡的雄性ApoE-/-小鼠給予高脂喂養(yǎng)2周后，予右側(cè)頸總動脈套管以誘發(fā)AS斑塊形成。套管術(shù)

22、后繼續(xù)高脂喂養(yǎng)，術(shù)后6周將ApoE-/-小鼠隨機分為2組（每組20只）:A:辛伐他汀組（辛伐他汀溶于0.5％methylcellulose，按50mg/kg/d量灌胃）;B:Control組（同體積的0.5％methylcellulose單獨灌胃）。治療6周后處死動物。
　　 3.2、血脂檢測
　　 試驗14周末，收集小鼠血清，檢測總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(

23、HDL-C)的水平。
　　 3.3、組織病理學(xué)的檢測
　　 制備頸動脈切片，免疫組織化學(xué)的方法檢測頸動脈斑塊內(nèi)Foxp3、IL-4、IL-1β、IFN-γ和IL-17的表達。
　　 3.4、RT-PCR0收集右側(cè)頸頸動脈組織，提取RNA，檢測頸動脈內(nèi)Foxp3、TGF-β、IL-10、IL-4、IL-1β、IFN-γ和IL-17mRNA的表達。
　　 3.5、Westernblot
　　 收集右側(cè)

24、頸動脈組織，提取蛋白，檢測頸動脈內(nèi)Foxp3、TGF-β和IL-I0蛋白的表達。
　　 3.6、ELISA檢測
　　 收集小鼠血清，檢測IL-10、IFN-γ和IL-17的水平濃度。
　　 3.7、細胞培養(yǎng)
　　 抽取ACS患者外周血，提取外周單核細胞后，置于含有10％FBS和1％雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×106cells/ml。隨機分為三組:(1)Control組;(2)低劑量辛伐他

25、汀組（培養(yǎng)基中加入1μM辛伐他汀）;(3)高劑量辛伐他汀組（培養(yǎng)基中加入10μM辛伐他?。?。細胞培養(yǎng)96小時后，流式細胞儀檢測3組Foxp3表達。另外，利用磁珠從ACS患者外周血中分選出Tregs和CD4+CD25-T細胞，將Tregs和CD4+CD25-T細胞按不同的比率(1∶1，1∶2，1∶4，1∶8)在anti-CD3和抗原提呈細胞存在的情況下孵育72小時后，加入1μCi[3H]-thymidine繼續(xù)孵育16小時，評價Tregs

26、的抑制功能。
　　 4、結(jié)果：
　　 4.1、動物一般情況
　　 兩組ApoE-/-小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的水平濃度無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 4.2、辛伐他汀上調(diào)Foxp3、TGF-β和IL-10的表達
　　 免疫組化結(jié)果顯示，6周辛伐他汀治療明顯增加了斑塊內(nèi)Foxp3的表達。同時，RT-pCR和westernblot的結(jié)果也顯示，F(xiàn)oxp3的mRNA和蛋白的表達在辛伐他汀組較

27、對照組明顯增加，從而證明了辛伐他汀可增加頸動脈斑塊內(nèi)Tregs的數(shù)量。
　　 此外，我們發(fā)現(xiàn)Tregs相關(guān)的細胞因子TGF-β和IL-10的mRNA和蛋白的表達在辛伐他汀組較對照組明顯增加。
　　 4.3、Tregs改變頸動脈斑塊內(nèi)細胞因子的表達
　　 免疫組化結(jié)果顯示，與對照組相比，辛伐他汀明顯提高了頸動脈斑塊內(nèi)IL-4蛋白的表達，而降低了IL-1β、IL-17和IFN-γ蛋白的表達。RT-PCR結(jié)果顯示，與對

28、照組相比，辛伐他汀明顯提高了頸動脈斑塊內(nèi)IL-4mRNA的表達，而降低了IL-1β、IL-17和IFN-γmRNA的表達。
　　 4.4、Tregs對循環(huán)中細胞因子的影響
　　 ELISA結(jié)果顯示，與對照組相比辛伐他汀明顯提高了血清中抗炎因子IL-10的水平濃度，而降低了促炎因子IFN-γ和IL-17的水平。
　　 4.5、辛伐他汀促進ACS患者外周循環(huán)中Tregs的數(shù)量和功能
　　 流式細胞儀分析結(jié)果發(fā)

29、現(xiàn)10μM的辛伐他汀較對照組明顯提高了Tregs占CD4+T細胞的比率。雖然1μM的辛伐他汀輕度提高了Tregs占CD4+T細胞的比率，但與對照組相比未達到統(tǒng)計學(xué)差異。Tregs的功能試驗發(fā)現(xiàn)10μM的辛伐他汀較對照組明顯提高了Tregs對CD4+CD25-T細胞的抑制率，而1μM的辛伐他汀組與對照組則相比則無明顯差異。因此，辛伐他汀明顯提高了ACS患者外周血中Tregs的數(shù)量和功能。
　　 5、結(jié)論：
　　 (1)在A

30、poE-/-小鼠的AS斑塊模型中首次證明了他汀類藥物提高了AS斑塊內(nèi)Tregs的數(shù)量和相關(guān)細胞因子的表達，調(diào)節(jié)了Th1/Th2/Th17的平衡。
　　 (2)他汀類藥物明顯提高了ACS患者外周血中Tregs的數(shù)量和功能。
　　 (3)他汀對AS斑塊的穩(wěn)定作用可能部分是通過Tregs的活化。
　　 第三部分，調(diào)節(jié)性T細胞對ApoE-/-小鼠腹主動脈瘤的保護作用及其機制研究
　　 1、背景：
　　 腹

31、主動脈瘤（abdominalaorticaneurysm，AAA）是一種慢性血管退行性疾病，主要發(fā)生于60歲以上的老年人群，嚴(yán)重威脅人類的健康。動脈瘤發(fā)生后逐漸擴大，最后破裂出血而導(dǎo)致患者的死亡。目前，AAA具體的發(fā)病機制并沒有得到完全的闡明，也沒有發(fā)現(xiàn)特效的治療藥物，治療方式仍僅限于腔內(nèi)或有創(chuàng)的手術(shù)治療。但是并非所有的患者都適合手術(shù)治療，動脈瘤直徑較小(＜5cm)、無癥狀的患者和無法耐受手術(shù)的高齡患者因無法從手術(shù)治療中獲益而失去了徹底

32、治愈AAA的機會。因此找到一種有效而且安全的藥物治療的策略就顯得格外重要。
　　 AAA主要的病理學(xué)改變?yōu)閯用}中層彈力蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)的過度降解，血管壁平滑肌細胞的減少和炎癥細胞的浸潤[4,5]。ECM對于維持血管腔的完整和功能有重要的意義，ECM的過度降解有助于動脈管壁的擴張，在AAA的形成中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。炎癥過程貫穿于AAA形成和發(fā)展的始終，動脈瘤組織中發(fā)現(xiàn)炎癥

33、細胞浸潤和炎癥因子分泌的明顯增加。炎癥細胞的大量浸潤促進了炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)的釋放，交織成特定的炎性網(wǎng)絡(luò)，有助于管壁組織的破壞，導(dǎo)致最終的管壁變薄和擴張。MMPs，特別是MMP-2和MMP-9是動脈瘤內(nèi)主要的蛋白水解酶，其對ECM的降解是AAA發(fā)病的主要機制。動物實驗證明炎癥反應(yīng)的減弱和MMPs釋放的減少可抑制AAA的形成。
　　 研究發(fā)現(xiàn)AAA具有許多自身免疫

34、性疾病的特點，提示免疫系統(tǒng)參與了AAA病理過程。調(diào)節(jié)性T細胞（CD4+CD25+regulatoryTcells，Tregs）是一類特殊CD4+T細胞亞群，在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)平衡、維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及控制自身免疫性疾病的進展中發(fā)揮了重要作用。Tregs數(shù)量缺失或功能失活會破壞機體免疫內(nèi)環(huán)境的平衡，導(dǎo)致自身免疫和炎癥反應(yīng)的無限放大。
　　 血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)誘導(dǎo)AAA形成的動物模型已經(jīng)在ApoE-/

35、-小鼠中成功的建立。免疫系統(tǒng)在AAA形成中已經(jīng)受到關(guān)注，但是，對于Tregs是否對AAA形成造成影響并未有研究報道。
　　 2、目的：
　　 (1)在ApoE-/-小鼠中構(gòu)建AngⅡ誘導(dǎo)AAA的動物模型。
　　 (2)觀察Tregs是否預(yù)防在ApoE-/-小鼠中持續(xù)滴注AngⅡ所誘導(dǎo)的AAA形成。
　　 (3)探討Tregs預(yù)防AAA形成的內(nèi)在分子機制。
　　 3、方法：
　　 3.1、T

36、regs的分選
　　 無菌分離8周齡雄性C57BL/6J小鼠脾細胞，制備單個脾細胞懸液，利用磁珠分選技術(shù)制備純化的Tregs。根據(jù)分組要求將Tregs溶于無菌生理鹽水中。
　　 3.2、動物模型的建立
　　 12周齡雄性ApoE-/-小鼠150只隨機分為5組（每組30只），A:Control組（尾靜脈注射200μlPBS）;B:小劑量Tregs治療組（small-doseTregs組，SD組，尾靜脈注射105Tr

37、egs）;C:大劑量Tregs治療組（large-doseTregs組，LD組，尾靜脈注射106Tregs）;D:PC治療組（在尾靜脈注射106Tregs的同時腹腔注射100μgPC61）。兩周后上述操作重復(fù)一次。E:鹽水組。第一次注射后第二天，將植入式膠囊滲透壓泵埋藏于小鼠皮下，AngⅡ(1000ng/kg/min)(A、B、C和D組)或等量生理鹽水（E組）持續(xù)恒速泵入28天，并全程給予高脂飲食喂養(yǎng)。
　　 3.3、血壓測量<

38、br>　　 ApoE-/-小鼠血管緊張素Ⅱ注射前及注射后4周，每周利用小鼠測壓儀進行血壓的測量，每只實驗動物測量3次后取其平均值。
　　 3.4、組織病理學(xué)的檢測
　　 AngⅡ或鹽水治療28天后，給予所有ApoE-/-小鼠安樂死，并留取腹主動脈標(biāo)本，觀察AAA形成率，分型，并測量腹主動脈（腎上動脈段）的最大直徑。制備腹主動脈的冰凍切片，行H&E、Verhoeff彈力纖維染色，免疫組織化學(xué)的方法檢測腎上段腹主動脈內(nèi)MO

39、MA-2、SMCs、MCP-1、IL-6、MMP-2、MMP-9和COX-2的表達，同時行DHE和TUNEL檢測。
　　 3.5、細胞培養(yǎng)
　　 首先利用磁珠分選技術(shù)將Tregs和CD4+CD25-T細胞從健康人群外周血單核細胞中游離。人血管平滑肌細胞隨機分為5組:Control組（未做任何處理）;CD25-組（每孔細胞培養(yǎng)基中加入5×105CD4+CD25-T細胞）;Tregs組(每孔細胞培養(yǎng)基中分別加入1.25×10

40、5，2.5×105and5×105Tregs)。在anti-CD3抗體(50ng/ml)存在的情況下共培養(yǎng)48小時后，加入AngⅡ(1μM)繼續(xù)刺激24小時。
　　 3.6、RT-PCR
　　 收集小鼠腹主動脈組織或各組平滑肌細胞，提取RNA，檢測腹主動脈內(nèi)MCP-1、IL-6、MMP-2和MMP-9以及平滑肌細胞內(nèi)MCP-1、IL-6、ICAM-1、MMP-2和MMP-9mRNA的表達。
　　 3.7、West

41、ernblot
　　 收集小鼠腹主動脈組織或各組平滑肌細胞，提取蛋白，檢測頸動脈內(nèi)IL-10、ICAM-1、MMP-2和MMP-9以及平滑肌細胞內(nèi)MCP-1、IL-6、ICAM-1、MMP-2、MMP-9、FasL、COX-2和NF-κB蛋白的表達。
　　 3.8、ELISA檢測
　　 收集細胞上清，檢測IL-10的水平濃度。
　　 4、結(jié)果：
　　 4.1、ApoE-/-小鼠血壓變化
　　

42、 與單純注射鹽水組相比，4組AngⅡ輸注的小鼠SBP均顯著升高，Tregs的輸入后對SBP無影響。
　　 4.2、Tregs對AAA形成的影響
　　 AngⅡ輸注28天后，各組AAA的發(fā)生率分別為對照組80％，SD組76％，LD組27％和PC組71％，而單純鹽水組無AAA形成。我們觀察了實驗各組AAA的分型，發(fā)現(xiàn)對照組、SD組和PC組AAA大多是Ⅲ或者Ⅳ型，而LD組則是Ⅰ型居多。對腎上腹主動脈的最大直徑的測量發(fā)現(xiàn)，LD

43、組腹主動脈的最大直徑明顯低于對照組、SD組和PC組。因此，Tregs可劑量依賴性的降低AAA的發(fā)生率和嚴(yán)重性。
　　 4.3、HE和Verhoff彈力纖維染色
　　 AAA動脈壁彈力纖維斷裂、中斷，外膜增生肥厚，動脈管壁變薄，呈瘤樣擴張，可伴有血栓形成，LD組則部分的逆轉(zhuǎn)了AngⅡ誘導(dǎo)的動脈管壁組織學(xué)的變化。
　　 4.4、Tregs對動脈瘤細胞構(gòu)成的影響
　　 免疫組化方法證實，LD組巨噬細胞含量明顯低

44、于對照組、SD組和PC組;平滑肌細胞的含量則明顯高于對照組、SD組和PC組。
　　 4.5、Tregs對炎癥和抗炎因子表達的影響
　　 LD組腎上段腹主動脈組織促炎因子MCP-1、IL-6和ICAM-1mRNA和蛋白的表達明顯低于對照組、SD組和PC組。體外實驗中，Tregs組MCP-1、IL-6和ICAM-1mRNA和蛋白的表達則明顯低于對照組和CD25-組。
　　 另一方面，LD組腎上段腹主動脈組織抗炎因子I

45、L-10蛋白的水平明顯高于對照組、SD組和PC組。體外實驗中，Tregs組IL-10的水平明顯高于對照組和CD25-組。
　　 4.6、Tregs降低MMP-2和MMP-9的表達
　　 體內(nèi)試驗中，RT-PCR、免疫組織化學(xué)和westernblot檢測腎上段腹主動脈組織，發(fā)現(xiàn)LD組MMP-2和MMP-9mRNA和蛋白的表達較對照組、SD組和PC組明顯下降。
　　 體外實驗中，Tregs組MMP-2和MMP-9mR

46、NA和蛋白的表達均明顯低于對照組和CD25-組。
　　 4.7、Tregs減少ROS的產(chǎn)生
　　 DHE方法檢測腎上段腹主動脈組織ROS的表達，發(fā)現(xiàn)對照組、SD組和PC組的組織伴有較強的紅色熒光，而LD組紅色熒光則相對較弱，差異具有顯著性意義。
　　 4.8、Tregs減少平滑肌細胞凋亡
　　 體內(nèi)試驗中，TUNEL陽性細胞數(shù)量在LD組較對照組、SD組和PC組明顯降低。
　　 體外試驗中，AngⅡ

47、刺激SMCs后，Tregs組FasL蛋白表達水平較對照組和CD25-組顯著下降。
　　 4.9、Tregs抑制COX-2的表達
　　 COX-2蛋白的表達在LD組較對照組、SD組和PC組明顯降低。
　　 體外實驗中，COX-2蛋白的表達在Tregs組較對照組和CD25-組明顯下降。4.10Tregs抑制NF-κB通路的活化
　　 Tregs組NF-κBp65蛋白的表達較對照組和CD25-組明顯降低。