血管內(nèi)皮生長因子對肺癌細胞株藥物敏感性影響的初步研究.pdf

1、第一部分外源性VEGF對肺癌細胞系A(chǔ)549體外藥物敏感性的影響
　　 目的考察外源性血管內(nèi)皮生長因子對體外培養(yǎng)的A549肺癌細胞增殖，細胞凋亡，化療藥物敏感性的影響，并觀察VEGF-VEGFR2-PI3K/Akt信號通路在其中的作用。從而初步探討VEGF對肺癌細胞生物學影響及機制。
　　 方法分別在含有10％、0.5％、0％血清濃度的培養(yǎng)基中，加入不同濃度梯度外源性VEGF培養(yǎng)A549細胞，MTT實驗檢測VEGF對于細胞

2、生長及生存的影響；確定順鉑、吉西他濱、多烯紫杉醇的適合作用濃度，MTT法比較加入與否外源性VEGF時A549細胞對上述化療藥物的敏感性；MTT法比較加入外源性VEGF時抑制VEGF-VEGFR2-PI3K/Akt信號通路與否對于A549細胞的藥物敏感性的影響；Western-blot實驗檢測加入VEGF時細胞VEGF-VEGFR2-PI3K/Akt信號通路中Akt蛋白磷酸化的變化；流式細胞儀檢測VEGF+化療藥物組與單純化療組相比，細胞

3、周期及凋亡的變化情況。
　　 結(jié)果：1、向含10％及0.5％血清的培養(yǎng)基中加入不同濃度梯度外源性VEGF，細胞的增殖及凋亡變化不顯著。應(yīng)用不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細胞，MTT示分別加入50ng/ml，100ng/ml，500ng/m1外源性VEGF均能使促進其增殖及生存，流式細胞分析示加入100ng/ml外源性VEGF細胞S期及G2期比例增加，G1期比例下降。2、MTT法示在0.5％血清的培養(yǎng)基中應(yīng)用適宜濃度的順鉑、吉西他濱

4、、多烯紫杉醇殺傷細胞的同時加入外源性VEGF能夠顯著提高細胞生存，應(yīng)用VEGF-VEGFR2-PI3k/Akt信號通路的抑制劑能夠阻斷這種效應(yīng)，流式細胞分析示加入VEGF組與對照組相比化療誘導的細胞凋亡明顯減少。3、Western-blot實驗示外源性VEGF對細胞中Akt磷酸化的激活作用于30分鐘至2小時達到最強，隨時間發(fā)展逐漸減弱，加入VEGF信號通路抑制劑能夠減弱VEGF對Akt磷酸化的激活作用。
　　 結(jié)論1、無血清培養(yǎng)

5、基培養(yǎng)細胞時，VEGF可延長A549細胞的存活時間。2、向細胞培養(yǎng)基中加入外源性VEGF可拮抗順鉑、吉西他濱、多烯紫杉醇對于A549細胞誘導的凋亡作用。3、VEGF拮抗A549細胞的凋亡作用與VEGF-VEGFR-PI3K/Akt通路相關(guān)。
　　 第二部分 RNAi聯(lián)合化療藥物對于肺腺癌細胞系A(chǔ)549殺傷作用的研究
　　 目的探討由質(zhì)粒載體介導的針對VEGF的RNAi對A549肺癌細胞中VEGF的表達、A549細胞增殖的

6、影響及RNAi聯(lián)合化療藥物對腫瘤的殺傷作用，為RNA干擾技術(shù)在肺癌治療領(lǐng)域中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
　　 方法將攜帶有針對VEGF的RNAi表達框架的真核表達載體pRS-VEGF-shRNA質(zhì)粒于DH5a大腸桿菌中擴增并進行測序鑒定，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入A549細胞，RT-PCR法檢測VEGF mRNA表達被抑制情況，ELISA法檢測培養(yǎng)細胞上清液中VEGF蛋白表達，MTT法檢測轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒對于A549細胞的增殖與凋亡的

7、影響，MTT法檢測RNAi與順鉑、吉西他濱或多烯紫杉醇共同作用時細胞的增殖與凋亡的變化。
　　 結(jié)果：1、質(zhì)粒pRS-VEGF-shRNA進行擴增后，測序結(jié)果顯示其具有能夠抑制VEGF表達的shRNA序列。2、RT-PCR法示與對照組比較，48小時后質(zhì)粒pRS-VEGF-shRNA轉(zhuǎn)染組VEGF mRNA表達量顯著降低。3、ELISA法示轉(zhuǎn)染組細胞上清液中VEGF蛋白含量顯著降低，與RT-PCR結(jié)果相一致。4、轉(zhuǎn)染后48h，MT