miR-1307對卵巢癌細胞藥物敏感性的影響及其作用機制.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  本研究通過擴大臨床樣本明確miR-1307及CIC mRNA與蛋白在化療耐藥與敏感卵巢癌組織中的表達情況及與耐藥的關(guān)系,研究二者的相關(guān)性及與化療耐藥與敏感卵巢癌臨床病理生物學(xué)特征之間的關(guān)系,探討miR-1307作為卵巢癌耐藥預(yù)測生物學(xué)標(biāo)志的可能性。
  同時,構(gòu)建miR-1307過表達及抑制表達載體分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入紫杉醇敏感及耐藥的卵巢癌細胞系,隨后加入不同濃度紫杉醇處理,通過細胞增殖實驗、藥物敏感性實驗、凋亡及周

2、期檢測等方法研究miR-1307改變后耐藥及敏感卵巢癌細胞系生物學(xué)行為的變化情況,以探索體外條件下改變miR-1307水平對卵巢癌細胞紫杉醇藥物敏感性的影響,明確miR-1307在卵巢癌紫杉醇耐藥中的作用。
  最后,通過研究卵巢癌細胞中miR-1307靶向調(diào)控CIC蛋白表達的作用,并通過改變miR-1307的表達研究RAS、ERK與ETV4、ETV5的表達變化,干擾CIC蛋白表達研究CIC蛋白對卵巢癌細胞紫杉醇藥物敏感性的影響,

3、以研究miR-1307通過調(diào)控CIC蛋白的表達影響RAS、ERK與ETV4、ETV5介導(dǎo)的卵巢癌細胞對紫杉醇的藥物敏感性的作用。
  方法:
  一、實驗對象
  選取2009年1月至2012年1月中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科確診為卵巢癌的患者,經(jīng)手術(shù)切除卵巢病灶且經(jīng)病理學(xué)檢查證實為卵巢漿液性囊腺癌的新鮮組織標(biāo)本。所有患者術(shù)后均行TP方案(紫杉醇+鉑類)化療,完成TP方案化療療程后均進行隨訪。
  二、實驗方法

4、
  (一)化療耐藥與敏感卵巢癌組織miR-1307、CIC mRNA與蛋白表達及其相關(guān)性研究
  1、采用RNA提取、蛋白提取、反轉(zhuǎn)錄、real time PCR、western blot等方法檢測化療耐藥與敏感卵巢癌組織miR-1307、CIC mRNA與蛋白的表達并進行Spearman等級相關(guān)分析;
  2、應(yīng)用方差齊性檢驗、Bonferroni檢驗等統(tǒng)計學(xué)方法分析miR-1307及CIC蛋白表達水平與卵巢癌臨床

5、病理生物學(xué)特征之間的關(guān)系;
 ?。ǘ﹎iR-1307對卵巢癌細胞紫杉醇藥物敏感性的影響
  1、采用細胞培養(yǎng)、細胞轉(zhuǎn)染、雙酶切、PCR擴增、DNA連接、重組載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及單克隆篩選、DNA測序等方法構(gòu)建miR-1307過表達及抑制表達載體,培養(yǎng)miR-1307穩(wěn)定過表達及抑制表達的SKOV3、SKOV3-TR30細胞系。
  2、采用MTT、凋亡檢測及細胞周期檢測等方法,配合細胞培養(yǎng)等方法研究miR-1307穩(wěn)定

6、過表達及抑制表達的SKOV3及SKOV3-TR30細胞的細胞生物學(xué)特征的變化及對紫杉醇的藥物敏感性。
 ?。ㄈ﹎iR-1307調(diào)控CIC介導(dǎo)的卵巢癌細胞藥物敏感性的分子機制研究
  1、采用細胞培養(yǎng)、細胞轉(zhuǎn)染、雙酶切、PCR擴增、DNA連接、重組載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及單克隆篩選、DNA定點突變、DNA測序、雙熒光素酶報告基因檢測等方法研究miR-1307與CIC3'-UTR區(qū)的直接結(jié)合作用。
  2、采用細胞培養(yǎng)、細胞瞬

7、時轉(zhuǎn)染、western blot的方法培養(yǎng)CIC抑制表達的SKOV3細胞并進行CIC蛋白含量檢測以確定CIC siRNA的抑制作用。
  3、采用細胞培養(yǎng)、細胞瞬時轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建miR-1307及CIC蛋白表達均抑制的SKOV3-TR30細胞,并通過western blot方法檢測CIC含量的變化。
  結(jié)果:
  一、化療耐藥與敏感卵巢癌組織miR-1307、CIC mRNA與蛋白表達及其相關(guān)性研究
  1、m

8、iR-1307在化療耐藥卵巢癌組織中的相對表達量高于化療敏感卵巢癌組織,差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義。
  2、CIC mRNA在化療耐藥卵巢癌組織中相對表達量高于化療敏感卵巢癌組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
  3、與化療敏感組相比,化療耐藥組中CIC蛋白表達明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
  4、CIC蛋白表達主要位于細胞胞漿,亦有細胞核表達。40例卵巢癌組織CIC蛋白細胞漿高表達陽性率為67.5%(27/40),中度表達陽性率為

9、27.5%(11/40),低表達陽性率5%(2/40),細胞核表達率為22.5%(9/40)。
  二、miR-1307對卵巢癌細胞紫杉醇藥物敏感性的影響
  1、成功構(gòu)建miR-1307過表達載體及抑制表達載體。
  2、CIC蛋白的相對表達量明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
  3、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-1307過表達載體的SKOV3細胞miR-1307相對表達量高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-1307抑

10、制載體的SKOV3-TR30細胞miR-1307相對表達量低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
  三、miR-1307調(diào)控CIC介導(dǎo)的卵巢癌細胞藥物敏感性的分子機制研究
  1、miR-1307與CIC3'-UTR區(qū)具有直接結(jié)合作用。
  2、轉(zhuǎn)染過表達miR-1307后,CIC mRNA相對表達量與CIC蛋白表達均明顯降低,與對照組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。轉(zhuǎn)染抑制表達miR-1307后CIC mRNA相對表達量、CIC

11、蛋白表達均明顯升高,與對照組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
  3、轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定過表達miR-1307的SKOV3細胞中ETV4、ETV5蛋白表達增加,RAS蛋白及p-ERK蛋白表達增加,與對照細胞相比,增加的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定抑制表達miR-1307的SKOV3-TR30細胞中ETV4、ETV5蛋白表達減少,RAS蛋白及p-ERK蛋白表達減少,與對照細胞相比,減少的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
  結(jié)論:
  1、化療

12、耐藥卵巢漿液性癌組織miR-1307的表達量高于敏感組織,而且miR-1307表達水平的ROC曲線分析結(jié)果顯示其可以作為預(yù)測卵巢癌患者化療耐藥的指標(biāo)之一,說明miR-1307可能與卵巢癌化療耐藥有關(guān)。
  2、在卵巢漿液性癌組織中,CIC蛋白表達主要位于細胞胞漿,亦有細胞核表達?;熌退幝殉矟{液性癌組織CIC蛋白細胞漿高表達陽性率、細胞核表達陽性率與CIC蛋白表達量均低于敏感組織,而且miR-1307與CIC蛋白的表達量成負相關(guān)關(guān)

13、系,推測miR-1307及CIC在卵巢癌耐藥中可能起一定作用。
  3、miR-1307及CIC蛋白的表達均與卵巢癌患者的臨床病理生物學(xué)特征無明顯相關(guān)性,但二者都與卵巢癌的耐藥相關(guān)。
  4、miRNA-1307在紫杉醇耐藥卵巢癌細胞系SKOV3-TR30中表達高于敏感細胞系SKOV3; CIC mRNA表達在紫杉醇耐藥及敏感卵巢癌細胞系中的差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但CIC蛋白在紫杉醇敏感卵巢癌細胞系SKOV3中表達高于耐藥卵巢癌

14、細胞系SKOV3-TR30;即在紫杉醇耐藥與敏感卵巢癌細胞中miR-1307與CIC蛋白的表達均呈相反趨勢。
  5、miR-1307表達升高使卵巢癌細胞增殖能力增強,凋亡減少,S期細胞百分比增加,IC50增高,經(jīng)紫杉醇處理后,相同濃度紫杉醇對細胞抑制率降低,凋亡及阻滯在G2期細胞百分比減少,提示miR-1307表達增強了卵巢癌細胞惡性生物學(xué)行為,抑制了卵巢癌細胞對紫杉醇的敏感性,促進耐藥的產(chǎn)生;miR-1307表達降低使卵巢癌細

15、胞增殖能力減弱,凋亡增加,S期細胞百分比降低,IC50降低,經(jīng)紫杉醇處理后,相同濃度紫杉醇對細胞抑制率升高,凋亡及阻滯在G2期細胞百分比增加,提示miR-1307表達降低抑制了卵巢癌細胞惡性生物學(xué)行為,增加了卵巢癌細胞對紫杉醇的敏感性,抑制耐藥的產(chǎn)生。因此認為,miR-1307表達水平的改變既即影響了卵巢癌細胞生物學(xué)行為,又影響了卵巢癌細胞對紫杉醇藥物的敏感性。
  6、miR-1307可能通過CIC影響卵巢癌細胞對紫杉醇藥物的敏

16、感性。
  7、卵巢癌細胞中miR-1307通過與CIC3'-UTR區(qū)靶向結(jié)合調(diào)控CIC表達。
  8、卵巢癌細胞中,隨著miR-1307表達升高或降低,RAS、活性p-ERK與ETV4、ETV5蛋白表達增加或減少,表明miR-1307靶向沉默CIC可影響RAS、ERK與ETV4、ETV5蛋白的表達。
  9、CIC表達降低促進卵巢癌細胞的增殖,IC50增高,相同濃度紫杉醇對細胞抑制率降低,凋亡及阻滯在G2期細胞百分比

17、減少,提示CIC表達降低抑制卵巢癌細胞對紫杉醇的敏感性,促進耐藥的產(chǎn)生。因此,CIC可調(diào)控卵巢癌細胞藥物敏感性,初步闡明miR-1307通過CIC影響卵巢癌細胞紫杉醇藥物敏感性。
  10、卵巢癌細胞中,隨著miR-1307與CIC表達同時降低,與僅有miR-1307表達下降的細胞相比,細胞的增殖能力重又增強,IC50增加,相同濃度紫杉醇對細胞抑制率降低,凋亡減少,阻滯在G2期細胞百分比減少,RAS蛋白、p-ERK蛋白及CIC的下

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