人參皂苷Rb1動員骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞防治兔自體靜脈移植物再狹窄的實驗研究.pdf

1、第一部分人參皂苷Rb1動員自體靜脈移植兔骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的實驗研究
　　 背景與目的:內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，是一群具有游走功能并能增殖分化的幼稚細(xì)胞，不僅可以遷移至外周血中分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，參與胚胎時期的血管生成、出生后的新生血管的生長，還可以在一定條件下轉(zhuǎn)化為平滑肌細(xì)胞，并且能夠歸巢在內(nèi)皮細(xì)胞受損部位，分化為內(nèi)皮細(xì)胞，參與受損內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)，為靜脈血管橋的再狹窄的預(yù)防提供了新的思路。內(nèi)皮祖細(xì)胞來源廣泛

2、，且具有易于分離、增殖能力強等多方面的特點，已成為血管組織工程中一種重要的種子細(xì)胞。正常情況下成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞與內(nèi)皮的損傷以及內(nèi)皮祖細(xì)胞對血管內(nèi)皮的修復(fù)處于一種動態(tài)的平衡之中。病理狀態(tài)下，機體儲備的內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖并釋放入外周血，并向內(nèi)皮損傷部位定向遷移、粘附，協(xié)助修復(fù)損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞，有效的減輕靜脈橋血管的再狹窄。靜脈移植術(shù)后的再狹窄，末期主要是粥樣硬化，而血管內(nèi)皮損傷是其始動因素，內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，巨噬細(xì)胞粘附、浸入及平滑肌細(xì)胞過度增

3、殖導(dǎo)致受損血管管腔狹窄或者閉塞。促進(jìn)損傷血管的內(nèi)皮修復(fù)可有效抑制平滑肌細(xì)胞增殖及新生內(nèi)膜的形成，為治療靜脈移植血管的再狹窄提供了一個新的方向。
　　 以往的研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中的內(nèi)皮祖細(xì)胞的增生，但未見有關(guān)于其對骨髓中內(nèi)皮祖細(xì)胞影響的報道，實驗通過在建立動物血管移植模型的基礎(chǔ)上，觀察動物股骨骨髓中內(nèi)皮祖細(xì)胞表面標(biāo)志CD34+、CD133+和VEGFR2+的陽性表達(dá)情況，探討人參皂苷Rb1對自體靜脈移植兔

4、骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的影響。
　　 材料與方法:45只清潔級新西蘭兔隨機分為實驗組、模型組、對照組3組，每組15只。應(yīng)用“no-touch”技術(shù)獲取頸外靜脈后，剪斷頸總動脈，采用連續(xù)縫合方法端端吻合頸外靜脈一頸總動脈，建立頸外靜脈和頸總動脈移植的動物模型。4周后，取移植靜脈血管，利用HE染色觀察靜脈移植血管內(nèi)膜厚度以及內(nèi)膜/中膜厚度比，免疫組化觀察骨髓內(nèi)CD34+、CD133+和VEGFR2+陽性細(xì)胞情況，RT-PCR檢測骨髓內(nèi)C

5、D34+、CD133+和VEGFR2*陽性mRNA表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、移植靜脈橋血管狹窄程度觀察
　　 石蠟切片HE染色光鏡下觀察分析結(jié)果顯示：移植4周后的實驗組、模型組、對照組血管的內(nèi)膜厚度分別為(46.53±2.50)μm、(50.80±2.68)μm、(43.73±3.24)μm，各組間比較P<0.05，實驗組、模型組、對照組組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義。3組靜脈內(nèi)膜/中膜厚度比分別為(1.96±0

6、.06)、(2.11±0.07)、(1.81±0.09)，各組間比較P<0.05，實驗組、模型組、對照組組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2、骨髓免疫組化
　　 CD34+、CD133+和VEGFR2+陽性細(xì)胞觀察各組移植靜脈血管中可見CD34+、CD133+和VEGFR2+陽性細(xì)胞表達(dá).4周后，實驗組陽性細(xì)胞表達(dá)高于模型組，模型組陽性細(xì)胞表達(dá)高于對照組，實驗組、模型組、對照組組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3、骨髓R

7、T-PCRCD34+、CD133+和VEGFR2+基因表達(dá)情況觀察
　　 各組移植靜脈血管中可見CD34+、CD133+和VEGFR2+mRNA表達(dá)，CD34+在實驗組、模型組、對照組表達(dá)的相對系數(shù)分別是(2.32±0.08)、(2.08±0.12)、(1.88±0.11)，各組間比較P<0.05，實驗組、模型組.對照組組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義；CD133+在實驗組、模型組、對照組表達(dá)的相對系數(shù)分別是(2.46±0.12).(2.2

8、4±0.09).(1.97±0.15)，各組間比較P<0.05，實驗組、模型組，對照組組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義；VEGFR2+在實驗組、模型組.對照組表達(dá)的相對系數(shù)分別是(1.92±0.14)，(1.79±0.15).(1.55±0.09)，各組間比較P<0.05，實驗組、模型組、對照組組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1.自體靜脈移植兔骨髓CD34+、CD133+和VEGFR2+表達(dá)增強；
　　 2.人參

9、皂苷Rb1能夠促進(jìn)骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的增生。
　　 第二部分人參皂苷Rb1抑制兔自體靜脈移植物再狹窄的實驗研究
　　 背景與目的:冠狀動脈旁路移植術(shù)(CABG)是治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的主要方法之一，大隱靜脈作為冠脈旁路移植術(shù)的主要材料，由于位置表淺，取材方便，并且有足夠的長度連接主動脈與遠(yuǎn)端的冠狀動脈，使其在臨床上得以廣泛應(yīng)用。但是手術(shù)操作造成的血管內(nèi)膜損傷、血流動力學(xué)改變以及炎癥因子釋放等一系列變化引起靜脈橋血管術(shù)

10、后再狹窄，使得靜脈橋血管在臨床上的應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)期效果欠佳。近年來，一系列預(yù)防靜脈移植血管再狹窄的方法，如藥物治療、基因治療、血管外支架、擴張液、內(nèi)皮祖細(xì)胞等應(yīng)用于臨床，但是均未取得明確效果。有報道稱：人參皂苷Rb1對抑制靜脈橋血管再狹窄有一定的積極作用。實驗即是在建立自體靜脈移植血管動物模型的基礎(chǔ)上，通過腹腔注射一定劑量的人參皂苷Rb1成品，觀察靜脈移植血管內(nèi)膜厚度的變化以及血管內(nèi)膜中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β

11、)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的變化，探討人參皂苷Rb1對自體靜脈移植血管再狹窄的抑制作用，為以后的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 材料與方法:45只清潔級新西蘭兔隨機分為實驗組、模型組、對照組3組，每組15只。應(yīng)用“no-touch”技術(shù)獲取頸外靜脈后，剪斷頸總動脈，采用連續(xù)縫合方法端端吻合頸外靜脈和頸總動脈，建立頸外靜脈一頸總動脈搭橋的動物模型。4周后，取靜脈移植血管，利用HE染色觀察靜脈移植血管內(nèi)膜厚度以及內(nèi)膜/中膜厚度

12、比，免疫組化觀察靜脈移植血管增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)陽性細(xì)胞指數(shù)、TGF-β、eNOS變化情況，RT-PCR檢測靜脈移植血管中TGF-β、eNOS mRNA基因的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、移植靜脈橋血管狹窄程度觀察：石蠟切片HE染色光鏡下觀察分析結(jié)果顯示：移植4周后的實驗組、模型組、對照組血管的內(nèi)膜厚度分別為(46.53±2.50)μm、(50.80±2.68)μm、(43.73±3.24)μm，各組間比較P<0

13、.05，實驗組、模型組、對照組組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義。三組靜脈內(nèi)膜/中膜厚度比分別為(1.96±0.06)、(2.11±0.07)、(1.81±0.09)，各組間比較P<0.05，實驗組、模型組、對照組組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2、移植靜脈橋血管免疫組化染色結(jié)果觀察：各組移植靜脈血管中可見PCNA、eNOS、TGF-β陽性細(xì)胞表達(dá)。移植4周后的實驗組、模型組、對照組PCNA陽性表達(dá)指數(shù)分別是(40.63±2.30)、(60.4

14、5±3.38)、(19.89±2.56)，各組間比較P<0.05，實驗組、模型組、對照組組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗組、模型組、對照組TGF-β陽性表達(dá)指數(shù)分別是(18.15±4.31)、(29.28±6.37)、(12.63±3.72)，各組間比較P<0.05，實驗組、模型組、對照組組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗組、模型組、對照組eNOS陽性表達(dá)指數(shù)分別是(25.64±5.03)、(17.91±3.75)、(10.25±2.31)，各組間比

15、較P<0.05，實驗組、模型組、對照組組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3、移植靜脈橋血管RT-PCR結(jié)果觀察：各組移植靜脈血管可見eNOS、TGF-β基因表達(dá)。eNOS在實驗組、模型組、對照組表達(dá)的相對系數(shù)分別為(2.12±0.05)、(1.98±0.09)、(1.72±0.09)，eNOS在實驗組中表達(dá)的相對系數(shù)高于模型組和對照組，各組間比較P<0.05，實驗組、模型組、對照組組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義。TGF-β在實驗組、模型組、對

16、照組表達(dá)的相對系數(shù)分別為(1.95±0.08)、(2.10±0.01)、(1.82±0.01)，TGF-β在模型組中表達(dá)的相對系數(shù)高于實驗組和對照組，各組間比較P<0.05，實驗組、模型組、對照組組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1、內(nèi)膜損傷是移植靜脈血管再狹窄的始動因素，血管壁重塑是靜脈血管產(chǎn)生再狹窄的根本原因。
　　 2、人參皂苷Rb1能夠有效的防治移植靜脈血管再狹窄。
　　 3、人參皂苷R