hPPARs天然配體篩選平臺(tái)的建立及應(yīng)用.pdf

1、目的：建立人過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體(human peroxisomeprolifterator-activated receptors，hPPARs)配體的篩選平臺(tái)，并從中藥單體中篩查hPPARs的天然配體。 方法：從人肝癌組織提取總RNA，RT-PCR擴(kuò)增出hPPARs配體結(jié)合區(qū)(ligand binding domain，LBD)cDNA，將其克隆入表達(dá)載體pMAL-p2x麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose binding

2、protein，MBP)編碼基因malE序列的下游，轉(zhuǎn)化入Ecoli.TB1。含重組質(zhì)粒的宿主菌經(jīng)最佳優(yōu)化條件誘導(dǎo)后，超聲破碎取上清。產(chǎn)物用多糖親和樹(shù)脂進(jìn)行純化，純化的MBP-hPPARsLBD用Xa因子酶切、多糖親和樹(shù)脂層析、DEAE-52陰離子交換層析純化回收。放射性標(biāo)記配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)(radioligand binding assays，RBA)鑒定MBP-hPPARsLBD和hPPARsLBD的配體結(jié)合功能。高效液相色譜紫外檢測(cè)法

3、(high performance liquid chromatography and ultraviolet detection，HPLC-UV)建立hPPARsLBD配體的篩選平臺(tái)，并對(duì)待試中藥單體進(jìn)行篩選，用經(jīng)典的放射性標(biāo)記配基競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)(radioligand binding competition assays，RBCA)法對(duì)HPLC-UV法篩選結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)。反式激活報(bào)告基因法測(cè)定篩出藥物的功能活性。 結(jié)果：含重組質(zhì)

4、粒的宿主菌經(jīng)最佳優(yōu)化條件(0.4mmol/L，30℃振蕩培養(yǎng)6h)誘導(dǎo)，從1L培養(yǎng)物中可獲得約20mg MBP-hPPARsLBD，約占胞質(zhì)總蛋白的31％。經(jīng)純化以及酶切回收，獲得了電泳純的MBP-hPPARsLBD和hPPARsLBD，其產(chǎn)量分別為14mg/L和5mg/L，得率分別為70％和 45％。RBA顯示MBP-hPPARsLBD和hPPARsLBD的結(jié)合配體功能是等效的。根據(jù)分子排阻色譜分離(Molecular Exclusi

5、on Chromatography，MEC)理論建立了HPLC-UV法hPPARs配體篩選平臺(tái)。用該平臺(tái)對(duì)待試藥進(jìn)行了篩選，結(jié)果顯示小檗堿(berberine，Ber)和柚皮素(naringenin，Nar)能特異性結(jié)合hPPAR α，大豆苷元(daidzein，Dai)能特異性結(jié)合hPPAR α和hPPAR γ1。RCBA法結(jié)果與HPLC-UV法相同。用反式激活報(bào)告基因法測(cè)試待試中藥單體的功能活性，結(jié)果顯示，Dai、Ber和Nar能激

6、活hPPARα，Dai、Nar和姜黃素(curcumin，Cur)能激活hPPAR γ1，而Dai、Ber、Nar、虎杖苷(polydatin，Pol)對(duì)hPPAR δ有一定程度的激活作用。 結(jié)論：1)利用pMAL-p2x表達(dá)純化體系，獲得了大量、可溶的、電泳純的MBP-hPPARsLBD和hPPARsLBD。經(jīng)RBA鑒定，MBP的融合沒(méi)有影響hPPARsLBD的配體結(jié)合功能；2)HPLC-UV法為一種新的，簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、有