鉀離子通道調(diào)節(jié)劑高通量篩選技術(shù)平臺的建立及先導(dǎo)化合物篩選.pdf

1、KCNQ離子通道基因突變與許多遺傳疾病有關(guān)，目前發(fā)現(xiàn)共有KCNQ1-5五個亞型。其中KCNQ1與KCNE1共同編碼組成心肌上的延遲整流鉀離子通道，該通道的突變可以引起遺傳性QT間期延長綜合癥，并可致耳聾。KCNQ2和 KCNQ3通道共表達產(chǎn)生的電流已經(jīng)被證實是頸上交感神經(jīng)節(jié)記錄到的M電流分子基礎(chǔ)。KCNQ2/3基因突變或M通道功能失調(diào)與良性家族性新生兒驚厥癥、阿爾茲海默病和癲癇等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。KCNQ2/3通道的開放劑瑞替加濱降低

2、神經(jīng)元興奮性，可用于治療與過度神經(jīng)元興奮相關(guān)的疾病，如驚厥、癲癇和神經(jīng)性疼痛等。KCNQ4鉀離子通道由于其基因突變導(dǎo)致人類耳聾耳鳴等疾病，已成為耳聾耳鳴防治藥物的潛在靶點。因此，對KCNQ鉀通道和Kir2.3鉀通道靶點的調(diào)節(jié)劑研究有重要的潛在應(yīng)用價值。
　　 人們對鉀離子通道的調(diào)節(jié)劑廣泛需求促進了其高通量篩選技術(shù)的廣泛發(fā)展，其低消耗，快速，靈敏，準(zhǔn)確和高通量等特點更為適合我國的新藥研發(fā)技術(shù)領(lǐng)域的需求。
　　 一、鉀離子通

3、道調(diào)節(jié)劑高通量篩選技術(shù)平臺的建立和優(yōu)化
　　 目的：在建立KCNQ2/3、KCNQ4和Kir2.3鉀離子通道穩(wěn)定表達細胞系的基礎(chǔ)上，建立和優(yōu)化原子吸收Rb+流出測定高通量篩選技術(shù)，并完成近150多種化合物的篩選。
　　 方法：(1)建立穩(wěn)定表達Kir2.3通道蛋白的HEK293細胞株：用Lipofectin 2000轉(zhuǎn)染試劑將Kir2.3通道基因轉(zhuǎn)染到HEK293細胞，經(jīng)G418篩選，用全細胞膜片鉗技術(shù)檢測Kir2.3通

4、道蛋白在HEK293細胞中的功能。(2)建立和優(yōu)化原子吸收Rb+流出測定高通量篩選技術(shù)：配制濃度梯度銣標(biāo)準(zhǔn)溶液和設(shè)置10個相同濃度銣標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定ICR8000系統(tǒng)的準(zhǔn)確度和靈敏度；配制KCl濃度梯度去極化緩沖液，觀察其對Rb+外流的影響，尋求最佳胞外鉀濃度；將穩(wěn)定表達KCNQ2/3、KCNQ4和Kir2.3通道細胞接種于96孔培養(yǎng)板，給予含有待測化合物的去極化外液，觀察其對Rb+外流的影響從而完成鉀通道調(diào)節(jié)劑的篩選。
　　 結(jié)

5、果：(1)G418篩選培養(yǎng)14天形成陽性克隆。經(jīng)全細胞膜片鉗技術(shù)鑒定，該細胞系表達的Kir2.3通道電流具有內(nèi)向整流特性。在高鉀外液條件下翻轉(zhuǎn)電位0mV，與等濃度高鉀條件下由Nerst方程所得的鉀平衡電位相符，并且Ba2+能夠有效地抑制Kir2.3的電流。(2)①采用RbCl標(biāo)準(zhǔn)品，配制濃度梯度銣標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過原子吸收測定儀ICR8000系統(tǒng)測量標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收度，實驗結(jié)果表明ICR8000系統(tǒng)靈敏度很高，達到ppm單位級；標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)

6、R值可達0.999；重復(fù)測定10個標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度標(biāo)準(zhǔn)差SD為3.66[％]，變異系數(shù)CV為3.46[％]，均小于5[％]。②含20 mM KCl去極化緩沖液可以剛剛引起Rb+小量外流，是最佳胞外鉀濃度。③通過高通量篩選技術(shù)測得，對照藥Retigabine可以明顯增加細胞內(nèi)Rb+外流，且EC50值在0.05-0.15 mM，與文獻報導(dǎo)相符合(3)通過采用上述原子吸收Rb+流出測定的高通量篩選技術(shù)，我們已初步完成對近150種化合物的篩選。其中

7、系列Ⅰ代表化合物QO-26、QO-28、QO-58和QO-60具有激活KCNQ2/3通道的作用，EC50值分別為2.27±1.02 mM、1.46±0.36 mM、0.06±0.01 mM和0.15±0.02 mM。系列Ⅱ代表化合物KG-1和KG-25 EC50值分別為3.8±0.36 mM和2.29±0.67 mM。系列Ⅲ代表化合物JM3和JM4 EC50值分別為1.67±0.89 mM和2.41±0.78 mM。(4)KCNQ4鉀通

8、道靶點的篩選方法與KCNQ2/3通道靶點的篩選方法相同。其中代表化合物QO-26和QO-28 EC50值分別為23.92±0.43mM和21.73±9.72 mM。(5)BaCl2明顯抑制表達Kir2.3通道的細胞內(nèi)銣離子的流出至未給藥對照組的71.6[％]，與文獻相符。100 mM QO-28和300 mM QO-28分別使表達Kir2.3通道的細胞的銣離子流出量減少至對照組的51.7[％]和增加至對照組的131.7[％]；30 mM

9、 QO-58和100 mM QO-58分別使銣離子流出量減少至對照組的75.5[％]和增加至對照組的131.9[％]。
　　 結(jié)論：(1)成功建立起穩(wěn)定表達Kir2.3鉀通道HEK293細胞株。(2)成功建立以KCNQ2/3通道為靶點的高通量篩選平臺，并完成近150種化合物的篩選，篩選出能夠開放KCNQ2/3通道作用的三個系列具有創(chuàng)新性結(jié)構(gòu)的，近38個化合物具有開放KCNQ2/3通道的作用，其中26個化合物是首次合成。(3)成功

10、建立以KCNQ4通道為靶點的高通量篩選平臺，完成對近100種化合物的篩選，篩選出14個具有開放KCNQ4通道作用的化合物，與開放KCNQ2/3通道的化合物相同。(4)成功建立以Kir2.3通道為靶點的高通量篩選平臺，并發(fā)現(xiàn)QO-28和QO-58對Kir2.3通道作用為低濃度抑制高濃度開放。
　　 二、利用膜片鉗技術(shù)對高通量篩選所得鉀通道開放劑的深入研究目的：進一步驗證我們建立的高通量篩選方法是否成功，并選取代表化合物對其作用特征

11、進行較為深入研究。
　　 方法：利用電生理膜片鉗技術(shù)，觀察由高通量篩選所得鉀通道開放劑對KCNQ2/3和KCNQ4通道電流的影響，并深入觀察代表化合物QO-28和QO-58作用特征。
　　 結(jié)果：(1)100 mM濃度的QO-26、100 mM濃度的QO-28、10 mM濃度的QO-58和10 mM濃度的QO-60號化合物都可以明顯增大-40 mV電壓下KCNQ2/3通道電流，激活通道電流幅度與10 mM RTG 相近。

12、(2)10 mM濃度的QO-58、QO-60、KG-1和KG-5都可以明顯增大-40 mV、-20 mV、0 mV電壓下KCNQ4通道電流，增大電流幅度均高于10 mM RTG。(3)化合物QO-28對鉀通道選擇性的研究:①Q(mào)O-28先增加后抑制KCNQ1鉀通道電流，并使KCNQ1通道電流動力學(xué)特點由慢激活改變?yōu)榭旒せ?。②QO-28先增加后抑制Kir2.3鉀通道電流。(4)化合物QO-58能夠劑量依賴性增大KCNQ2/Q3電流，以-40

13、mV電壓下最大激活電流值為1標(biāo)準(zhǔn)化，用logistic方程對其進行擬合量效關(guān)系曲線得EC50=2.30±0.86 mM，斜率為0.60±0.14。(5)化合物QO-58能夠劑量依賴性增大KCNQ4電流，以-40mV電壓下最大激活電流值為1標(biāo)準(zhǔn)化，用logistic方程對其進行擬合量效關(guān)系曲線得EC50=0.60±0.09 mM，斜率為0.91±0.13。(6)QO-58能夠?qū)CNQ2/Q3通道電壓激活曲線向超極化方向移動，并呈濃度依賴

14、性作用。10 mM QO-058能夠?qū)⑵浒霐?shù)最大激活電壓 從給藥前的-13.2±0.1 mV左移至-58.2±0.2 mV。(7)QO-58能夠?qū)CNQ4通道電壓激活曲線向超極化方向移動。10 mM QO-058將其半數(shù)最大激活電壓 (V1/2)從給藥前的-22.0±1.4 mV左移至-80.7±2.9 mV。(8)10 mM QO-058能夠顯著增強大鼠背根神經(jīng)元中的M電流，其作用強度與10 mM 瑞替加濱相當(dāng)，可引起通道電流增大2

15、5[％]。(9)100 mM QO-58可以引起KCNQ1/KCNE1通道電流增大1倍。
　　 結(jié)論：(1)電生理膜片鉗技術(shù)確證KCNQ2/3通道和KCNQ4通道靶點高通量篩選結(jié)果。(2)化合物QO-28對KCNQ1鉀通道電流和Kir2.3鉀通道電流具有先增加后抑制作用。(3)化合物QO-58呈劑量依賴性增大KCNQ2/Q3通道和KCNQ4通道電流，其EC50值分別為2.30±0.86 mM和0.60±0.09 mM。(4)化合

16、物QO-58呈劑量依賴性使KCNQ2/3和KCNQ4通道電壓依賴性激活向超極化方向移動。(5)化合物QO-58能夠增大大鼠背根神經(jīng)元中的M電流。(6)化合物QO-58能夠增大KCNQ1/KCNE1通道電流。
　　 總結(jié)：
　　 1.成功建立起穩(wěn)定表達Kir2.3鉀通道HEK293細胞株。
　　 2.成功建立以KCNQ2/3通道為靶點的高通量篩選平臺，并完成近150種化合物的篩選，篩選出能夠開放KCNQ2/3通道作

17、用的三個系列具有創(chuàng)新性結(jié)構(gòu)的，近38個化合物具有開放KCNQ2/3通道的作用，其中26個化合物是首次合成。
　　 3.成功建立以KCNQ4通道為靶點的高通量篩選平臺，完成對近100種化合物的篩選，篩選出14個具有開放KCNQ4通道作用的化合物，與開放KCNQ2/3通道的化合物相同。
　　 4.成功建立以Kir2.3通道為靶點的高通量篩選平臺，并發(fā)現(xiàn)QO-28和QO-58對Kir2.3通道作用為低濃度抑制高濃度開放。

18、>　　 5.電生理膜片鉗技術(shù)確證KCNQ2/3通道和KCNQ4通道靶點高通量篩選結(jié)果。
　　 6.化合物QO-28對KCNQ1鉀通道電流和Kir2.3鉀通道電流具有先增加后抑制作用。
　　 7.化合物QO-58呈劑量依賴性增大KCNQ2/Q3通道和KCNQ4通道電流，其EC50值分別為2.30±0.86 mM和0.60±0.09 mM。
　　 8.化合物QO-58呈劑量依賴性使KCNQ2/3和KCNQ4通道電壓