抗氧化藥物篩選細胞模型的建立與應用.pdf

1、眾多疾病的發(fā)生、發(fā)展與機體氧化應激密切相關，如衰老、糖尿病、心血管疾病等。為尋找高效、低毒的抗氧化藥物，建立快速有效的篩選方法和篩選模型具有重要意義。本文旨在建立一種高效、簡便、高度敏感的高通量篩選抗氧化藥物的細胞模型，并應用于抗氧化候選藥物的初步篩選。Keapl-Nrf2-ARE信號通路調(diào)節(jié)機體內(nèi)多種抗氧化酶和II相解毒酶的表達，在氧化應激反應中起著重要作用。本研究利用抗氧化反應元件ARE調(diào)控熒光素酶報告基因的表達水平,建立抗氧化藥物

2、篩選細胞模型。
　　 構建由ARE調(diào)控熒光素酶報告基因表達的重組質粒載體pARE-Luc-Neo。采用MTT法評價G418對Hek293的毒性作用，確定G418最佳篩選濃度為800μg/mL。使用FuGENE(R)HD轉染試劑將pARE-Luc-Neo轉染Hek293細胞（人胚腎上皮細胞）。轉染24h后，通過G418篩選，稀釋法挑選陽性單克隆細胞株，獲得26株單克隆細胞株。單克隆細胞株經(jīng)Ⅱ相解毒酶誘導劑TBHQ誘導篩選，檢測細胞

3、中熒光素酶的活性，獲得熒光素酶高表達細胞株Hek293-ARE。利用TBHQ、白藜蘆醇、姜黃素和穿心蓮內(nèi)酯評價Hek293-ARE的篩選效果，結果表明TBHQ、白藜蘆醇、姜黃素和穿心蓮內(nèi)酯對Hek293-ARE細胞中熒光素酶的表達具有良好的誘導效果，且在一定范圍內(nèi)與誘導劑濃度呈劑量效應關系。從遺傳穩(wěn)定性和表達穩(wěn)定性兩方面驗證細胞模型的穩(wěn)定性，結果表明細胞模型穩(wěn)定性良好，經(jīng)過以上驗證表明成功建立了抗氧化藥物細胞篩選模型，Hek293-AR

4、E細胞可用于抗氧化物的初步篩選.
　　 將細胞模型應用于對現(xiàn)有的18種中藥單體的篩選，結果表明中藥單體熊果酸、隱丹參酮、黃連素、水飛薊素、芹菜素、染料木素、燈盞花素、黃芩苷、大豆苷元、漢黃芩素、大黃素和大黃酸對Hek293-ARE細胞中熒光素酶的表達有良好的誘導效果，并在一定范圍內(nèi)具有明顯的劑量效應關系，提示這12種中藥單體可能通過激活Keap1-Nrf2-ARE信號通路發(fā)揮其抗炎、抗氧化等作用。對蛹蟲草粗多糖的篩選結果表明，蛹

5、蟲草粗多糖對Hek293-ARE細胞中熒光素酶的表達有良好的誘導效果，并在一定范圍內(nèi)具有明顯的效應劑量關系，提示蛹蟲草粗多糖能夠誘導抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表達而起到抗氧化的作用。對蛹蟲草水提組分的篩選結果表明，2＃、3＃、4＃、7＃、11＃、12＃和14＃樣品對Hek293-ARE細胞中熒光素酶的表達有良好的誘導效果，提示這些組分可激活Keap1-Nrf2-ARE信號通路，從而可能具有抗氧化的作用。
　　 抗氧化藥物篩選細胞模型