人PPARγ-,1-LBD重組蛋白的制備及天然配體的篩選.pdf

1、目的：通過基因重組技術(shù)和分子生物化學(xué)方法制備高純度的、具有生物活性的hPPAR γ1(human peroxisome proliferator-activatedreceptor gammar one)受體蛋白；應(yīng)用該受體蛋白進(jìn)行hPPAγ1。受體的天然配體篩選。 方法： 1.以人脂肪組織總RNA為模板，利用RT-PCR方法擴(kuò)增出人PPAR γ1LBD基因的cDNA片段，將其插入表達(dá)載體pMAL-p2X的麥芽糖結(jié)合蛋白

2、(Maltose Binding Protein，MBP)編碼基因malE的下游，轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli.TB1。并對(duì)重組質(zhì)粒在大腸桿菌TB1中的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。 2.含重組質(zhì)粒的大腸桿菌經(jīng)優(yōu)化條件誘導(dǎo)后，超聲破菌取上清，所得雜蛋白經(jīng)多糖親和樹脂純化；產(chǎn)物再進(jìn)行Xa因子酶切、多糖親和樹脂層析、DEAE-52陰離子交換樹脂層析純化回收。 3.利用放射性配體飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)(radioligand saturationbind

3、ing assay，RSBA)對(duì)MBP-hPPAR γ1 LBD融合蛋白和hPPAR γ1LBD受體蛋白進(jìn)行功能鑒定。 4.利用放射性配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)(radioligand competitionbinding assay，RCBA)進(jìn)行hPPAR γ1天然配體的篩選，并測(cè)定所篩藥物的IC50值和Ki值。 結(jié)果： 1.重組質(zhì)粒pMAL-hPPAR γ1LBD經(jīng)BamH I和HindIII雙酶切，獲得分子量為90

4、9bp DNA條帶。 2.當(dāng)誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.4 mmol/L，30℃振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h時(shí)，含重組質(zhì)粒的E.col TBl高效表達(dá)MBP-hPPAR γ1 LBD融合蛋白(分子量80KD，20mg/L培養(yǎng)物)。融合蛋白經(jīng)親和樹脂純化后用Xa因子酶切純化回收獲得高純度hPPAR γ1LBD(5mg/L培養(yǎng)物)。 3.MBP-hPPAR γ1LBD和hPPAR γ1LBD與H3-ROS飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：兩者均能與H

5、3-ROS很好的結(jié)合，其Kd均為89 mmol/L。說明兩者結(jié)合配體的功能是等效的，具有生物活性。MBP不影響配體和受體結(jié)合。 4.從大豆苷元、小檗堿、姜黃素、虎杖苷、人生皂苷、辣椒堿、柚皮苷、柚皮素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯等中藥單體中篩選出了姜黃素為hPPAR γ1的配體。其IC50=8.82±0.74 μ mol/L，Ki=0.680 μmol/L。 結(jié)論：利用pMAL-p2x表達(dá)純化系統(tǒng)獲得了可溶的、高純度的、具