內(nèi)毒素休克小鼠HMGB1啟動(dòng)子結(jié)合蛋白的鑒定及其功能研究.pdf

1、高遷移率族蛋白B1是高遷移率族蛋白家族成員之一，1973年英國科學(xué)家Goodwin在牛胸腺細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)，因其在聚丙烯酰胺電泳中的高遷移率得名，它是一種含量豐富、分子量小、高度保守的染色質(zhì)相關(guān)非組蛋白。HMGB1分布十分廣泛，多種器官細(xì)胞中均有表達(dá)，并位于大多數(shù)細(xì)胞的胞核和胞漿中。最初發(fā)現(xiàn)其作為核因子直接參與基因表達(dá)調(diào)控，近年陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其具有豐富的生物學(xué)功能，包括參與腦的發(fā)育和神經(jīng)細(xì)胞生長、纖維蛋白溶酶原的活化、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、免疫細(xì)胞分化

2、以及廣泛參與全身的炎癥反應(yīng)和組織損傷等。 膿毒癥目前仍然是臨床危重患者的重要死因之一，其死亡率高達(dá)30～70％。研究表明，HMGB1作為重要的炎癥介質(zhì)在全身炎癥反應(yīng)過程中起重要作用。致炎刺激脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等激活的單核/巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)8～32h延遲后釋放HMGB1，同時(shí)壞死組織細(xì)胞崩解也釋放出大量的HMGB1。釋放到細(xì)胞外的HMGB1分子通過進(jìn)一步激活單核或內(nèi)皮等細(xì)胞，引起大量炎癥因子

3、和黏附分子的表達(dá)和釋放，導(dǎo)致并參與了包括腦組織、肺、胃腸道、關(guān)節(jié)、心臟等多種臟器的炎癥損傷以及廣泛的全身性炎癥反應(yīng)甚至死亡。由此可見，HMGB1在炎癥反應(yīng)過程中起著重要的中樞作用。 HMGB1在大多數(shù)細(xì)胞和組織中都控制在一個(gè)基礎(chǔ)的表達(dá)水平，但HMGB1并不是組成型表達(dá)，而是被嚴(yán)格調(diào)控的。在增殖組織和活化的分裂細(xì)胞，其表達(dá)水平可以提高2倍，在雌激素刺激的乳癌細(xì)胞中其表達(dá)量也可提高2倍以上；在用順氯氨鉑治療的癌癥中，其表達(dá)水平也升高

4、，且能夠增強(qiáng)順氯氨鉑的抗癌效果。不同刺激在不同細(xì)胞、不同種系可能通過不同的信號通路誘導(dǎo)HMGB1的表達(dá)，相關(guān)的調(diào)控機(jī)制也不盡相同。 Lum等人克隆并分析了人HMGB1基因的的上游區(qū)域和第一個(gè)內(nèi)含子，發(fā)現(xiàn)在乳癌(humanbreastadenocarcinomacellline，MCF-7)細(xì)胞中人HMGB1基因的轉(zhuǎn)錄起始于第一個(gè)內(nèi)含子一外顯含子交界處上游57個(gè)核苷酸的位點(diǎn)。人HMGB1基因的表達(dá)受TATA框缺失的啟動(dòng)子的調(diào)控，這

5、一啟動(dòng)子的活性比猴空泡病毒40(simianvacuolatingvirus40，SV40)強(qiáng)18倍之多。其中的沉默子能抑制啟動(dòng)子的活性至原來的六分之一，基因中的第一個(gè)內(nèi)含子包含有增強(qiáng)子，能使此啟動(dòng)子的活性增強(qiáng)2～3倍，因此我們設(shè)想HMGB1在此增強(qiáng)子的作用下其表達(dá)水平能夠明顯的提高，而我們在大多數(shù)細(xì)胞中觀察到HMGB1的基礎(chǔ)表達(dá)量可能是由于沉默子抑制作用。 參與內(nèi)毒素休克中HMGB1表達(dá)的信號調(diào)控通路也僅僅有一些初步的研究。G

6、ardella研究發(fā)現(xiàn)脂多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide-bindingprotein，LBP)/白細(xì)胞分化抗原14(clusterofdifferentiation14，CD14)作為LPS的結(jié)合受體，與HMGB1的基因表達(dá)密切相關(guān)，提示LPS可能通過LBP/CD14及其下游的信號激活單核/巨噬細(xì)胞，HMGB1從核內(nèi)移至胞漿中的細(xì)胞器，然后通過溶酶體的自溶、胞吐作用將HMGB1釋放出來。乙基丙酮酸通過抑制細(xì)胞外信號調(diào)

7、控激酶1/2(extracellularsignal-regulatedkinases1/2，ERK1/2)磷酸化和抑制巨噬細(xì)胞的活性也可以抑制HMGB1的釋放。Wang等人發(fā)現(xiàn)通過抑制蛋白酪氨酸激酶(Janusproteintyrosinekinase，JAK)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(signaltransducerandactivatoroftranscription，STATs)通路活化可明顯下調(diào)肝臟組織HMGB1mRNA表達(dá)，

8、從而有助于減輕膿毒癥大鼠的急性肝損傷。胥彩林等人則發(fā)現(xiàn)核因子KB(nuclearfactor-kappaB，NF-KB)抑制劑能顯著抑制內(nèi)毒素休克動(dòng)物組織(肝、肺、腎)HMGB1mRNA的表達(dá)，使各臟器損傷和功能得到明顯改善。由此可知上述信號分子所在信號通路可能參與了HMGB1的表達(dá)調(diào)控，但確切的機(jī)制目前仍不清楚。 基因表達(dá)的調(diào)控是細(xì)胞對外部或內(nèi)部的刺激發(fā)生應(yīng)答的方式，這是一個(gè)高度復(fù)雜，精確調(diào)控的過程，基因表達(dá)調(diào)控可以在復(fù)制、轉(zhuǎn)

9、錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯和翻譯后多等級水平上進(jìn)行，但DNA轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵控制點(diǎn)，即在一定時(shí)間、空間上，多種調(diào)節(jié)蛋白作用于特異的基因啟動(dòng)子的復(fù)雜過程，其本質(zhì)是DNA-蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間廣泛的相互作用。另外，人們發(fā)現(xiàn)，在基因表達(dá)調(diào)控過程中，往往不是單個(gè)因素起作用，而是多種調(diào)節(jié)因素相互交織，相互影響，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，最終使基因表達(dá)調(diào)控呈現(xiàn)出一種高度的有序性。鑒于這種廣泛的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與DNA相互作用網(wǎng)絡(luò)參與其中，

10、相關(guān)研究策略也層出不窮。其中，啟動(dòng)子DNA結(jié)合蛋白的研究是從轉(zhuǎn)錄水平上研究基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，以尋找新的蛋白質(zhì)為手段，以了解其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用為目的，從而最終為闡明某些疾病的發(fā)病機(jī)制及基因治療奠定基礎(chǔ)。目前，對啟動(dòng)子DNA結(jié)合蛋白的研究方法可分為兩大類：第一類是細(xì)胞內(nèi)法，以已知啟動(dòng)子DNA序列篩選出與其相結(jié)合的蛋白，通過生物信息分析來確定該蛋白質(zhì)；第二類是細(xì)胞外法，即在體外用重組的已知蛋白質(zhì)與啟動(dòng)子DNA結(jié)合。二者各有其自身的優(yōu)勢，又有各自的缺

11、陷。我們將以上二者結(jié)合應(yīng)用，以期達(dá)到既能找到未知調(diào)控蛋白，又能找到該蛋白質(zhì)的精確的結(jié)合位點(diǎn)并證實(shí)二者結(jié)合特異性的目的。 由此，我們以小鼠肝臟基因組DNA為模板，擴(kuò)增小鼠HMGB1基因5'非編碼區(qū)(noncodingregion，NCR)1378bp長的調(diào)控序列，將其插入pDsRed1-1紅色熒光素酶報(bào)告基因載體上。應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)基因共轉(zhuǎn)染技術(shù)將質(zhì)粒pDsRed1-1/HMGB1p導(dǎo)入NIH/3T3細(xì)胞，給予TNF-α持續(xù)刺激，觀

12、察紅色熒光蛋白表達(dá)情況，證明所得到的啟動(dòng)子序列具有轉(zhuǎn)錄活性，為進(jìn)一步研究HMGB1基因表達(dá)信號調(diào)控機(jī)制提供一個(gè)方便、可靠的工具。 同時(shí)，從“組學(xué)”的角度和活體組織水平，根據(jù)DNA-蛋白質(zhì)相互作用的原理，基于生物素-鏈親和素系統(tǒng)、磁珠分離μMACSTM系統(tǒng)，結(jié)合生物質(zhì)譜技術(shù)篩選了內(nèi)毒素休克小鼠的肝臟組織中與HMGB1啟動(dòng)子發(fā)生相互作用的結(jié)合蛋白。利用末端生物素(biotin)標(biāo)記的HMGB1啟動(dòng)子區(qū)引物，PCR擴(kuò)增制備帶bioti

13、n標(biāo)記的HMGB1啟動(dòng)子探針HMGB1p-biotin。制備BALB/c小鼠的內(nèi)毒素休克模型，提取肝臟組織核蛋白，與擴(kuò)增的HMGB1p-biotin探針行結(jié)合反應(yīng)，再以標(biāo)記有鏈親和素(streptavidin)的磁珠分離HMGB1p-biotin-蛋白反應(yīng)復(fù)合物，不同鹽濃度緩沖液洗脫結(jié)合的蛋白，使用聚丙稀酰胺凝膠電泳分離洗脫的樣品蛋白，并對凝膠行改良考染顯色，比較內(nèi)毒素休克組與正常對照組的差異條帶(DNApull-downassay)。

14、結(jié)果表明，在肝臟組織胞核中，調(diào)出11個(gè)差異蛋白，這些蛋白可能直接或間接參與了內(nèi)毒素休克小鼠肝臟中HMGB1的表達(dá)調(diào)控。其中有10個(gè)蛋白在LPS作用后與HMGB1啟動(dòng)子結(jié)合增加，提示這些蛋白可能參與了LPS作用后HMGB1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，多次重復(fù)均得到相同的結(jié)果。 對結(jié)果中出現(xiàn)的11個(gè)差異條帶進(jìn)行質(zhì)譜(massspectrometry，MS)鑒定，根據(jù)得到的肽指紋圖譜，利用Mascot查詢軟件搜索NCBI數(shù)據(jù)庫，綜合分析后得到7個(gè)與轉(zhuǎn)

15、錄調(diào)控有關(guān)的蛋白分子，分別為組蛋白2A(histone2A，H2A)、組蛋白2B(histone2B，H2B)、組蛋白3(histone3，H3)、組蛋白4(histone4，H4)、S100A9蛋白(myeloid-relatedprotein14，MRP14)、雙功能過氧化物酶(peroxisomalbifunctionalenzyme，Ehhadh)、乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶2(acetyl-CoenzymeAacyltransfer

16、ase2，ACox2)。其中，H3作為染色體結(jié)構(gòu)中高度保守的一類核心組蛋白，主要通過其乙?；降恼{(diào)節(jié)控制基因轉(zhuǎn)錄的“開”和“關(guān)”；乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶則參與氨基酸殘基乙?；磻?yīng)、MS鑒定得到的這些結(jié)果充分說明內(nèi)毒素休克小鼠中HMGB1基因的表達(dá)調(diào)控可能受到了多種因素的影響，這些因素相互協(xié)調(diào)，共同作用從而影響HMGB1基因的表達(dá)調(diào)控。 通過以上研究，我們得出：一、克隆出具有啟動(dòng)基因表達(dá)活性的HMGB1啟動(dòng)子DNA片段；二、構(gòu)建

17、了紅色熒光蛋白報(bào)告基因載體pDsRedl-1/HMGB1p，并在NIH/3T3細(xì)胞內(nèi)證實(shí)該啟動(dòng)子具有啟動(dòng)紅色熒光蛋白表達(dá)的活性，可有效用于HMGB1基因表達(dá)信號調(diào)控機(jī)制的研究；三、利用生物素.鏈親和素、磁珠分離μMACSTM系統(tǒng)成功篩選到參與HMGB1基因調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，在胞核蛋白中至少有11個(gè)蛋白可能參與了這一過程，并利用生物質(zhì)譜技術(shù)鑒定相關(guān)蛋白分別為H2A、H2B、H3、H4，S100A9，Ehhadh，ACox2。 本研究