園丁糖提取工藝研究及體外抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制研究.pdf

1、[目的]
　　 本文為同時(shí)含有陳皮和甘草兩味中藥材的園丁糖提供了一套全面、系統(tǒng)的檢測方法。為含此兩味中藥材的方劑中含有的橙皮苷和甘草酸的定量提供了一條有效、方便的途徑。
　　 園丁糖是由陳皮、甘草等多味中藥組成,用于咽喉腫痛、咳嗽痰盛、咽炎等癥。本文針對(duì)園丁糖工藝不完善,缺乏安全、有效、可靠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的問題,結(jié)合中藥品種的產(chǎn)業(yè)化、現(xiàn)代化和國際化進(jìn)程的要求,對(duì)該復(fù)方制劑中的提取工藝和質(zhì)量控制進(jìn)行了系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究。

2、>　　 中藥血清、血漿藥理學(xué)是一種適合中藥特點(diǎn)的進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的一種新的藥理方法學(xué),它排除了傳統(tǒng)中藥體外實(shí)驗(yàn)中中藥本身的理化性質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾,又能反映藥物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化過程及其作用結(jié)果。本研究在已有的研究基礎(chǔ)上,利用中藥血清、血漿藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法對(duì)園丁糖預(yù)防及治療鼻咽癌的作用進(jìn)行深入的研究,并通過HPLC、MTT、RT-PCR等技術(shù)進(jìn)一步探討園丁糖預(yù)防及治療鼻咽癌的作用機(jī)理。
　　 [方法]
　　 1.HPLC法同時(shí)

3、測定園丁糖中甘草酸和橙皮苷的含量
　　 本文采用色譜柱為Phenomenex C18柱(150mm x4.60mm,5μm),乙腈-3％醋酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,流速為1mL/min,檢測波長為260nm,柱溫為25℃,同時(shí)檢測橙皮苷和甘草酸的含量。
　　 2.園丁糖水提取工藝系統(tǒng)研究
　　 在提取工藝中,根據(jù)處方中有效成分和理化性質(zhì),通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以復(fù)方制劑中橙皮苷和甘草酸的含量作為指標(biāo),對(duì)水提取工藝的條件

4、進(jìn)行了優(yōu)選。
　　 3.園丁糖含藥血清、血漿抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE-1增殖的研究
　　 園丁糖提取液和生理鹽水灌胃新西蘭大白兔,每天一次,灌胃10d,于最后一次灌胃后,30min內(nèi)分離頸總動(dòng)脈取全血,園丁糖提取液灌胃組和生理鹽水灌胃組分別處理為不滅活含藥血清組、不滅活含藥血漿組、滅活含藥血清組、滅活含藥血漿組等,用HPLC法鑒定不滅活和滅活含藥血清、血漿;通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測不滅活和滅活含藥血清、血漿對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞的

5、抑制率。
　　 4.園丁糖20%濃度滅活含藥血清對(duì)鼻咽癌細(xì)胞PAR-2表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　 根據(jù)第三部分結(jié)果,采用20%濃度的含藥滅活血清處理鼻咽癌CNE-1細(xì)胞,于6h、12h、24h、48h后收集細(xì)胞,提取mRNA,RT-PCR檢測細(xì)胞中蛋白酶激活受體-2(PAR-2)表達(dá)變化。
　　 [結(jié)果]
　　 1.HPLC法同時(shí)測定園丁糖中甘草酸和橙皮苷的含量
　　 橙皮苷在50.9～407.2μ

6、g/mL的范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(R2=0.9995),平均回收率為97.85%,RSD為2.28%;甘草酸在50.8～404.0μg/mL的范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(R2=0.9992),平均回收率為98.12%,RSD為1.99%。
　　 2.園丁糖提取工藝系統(tǒng)研究
　　 結(jié)合方劑中藥物特性及制劑的一般要求,最終確定了提取工藝。最佳工藝為:超聲1小時(shí),加14倍水,60℃煮提2小時(shí)。
　　 3.園

7、丁糖含藥血清、血漿抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE-1增殖的研究
　　 用HPLC法鑒定含藥血清、血漿的制備,結(jié)果表明,含藥血清、血漿中不同程度的含有微量的橙皮苷和甘草酸,證明含藥血清、血漿的制作成功。應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度園丁糖未滅活含藥血清、未滅活含藥血漿、滅活含藥血清、滅活含藥血漿對(duì)鼻咽癌生長的抑制作用。結(jié)果表明在48h范圍內(nèi),隨著血清、血漿濃度的增加,園丁糖未滅活含藥血清、未滅活含藥血漿、滅活含藥血清、滅活含藥血漿相對(duì)于對(duì)照組對(duì)

8、鼻咽癌生長的抑制率呈增長的趨勢,呈現(xiàn)良好的量-效、時(shí)-效關(guān)系,且在20%濃度的園丁糖未滅活含藥血清、未滅活含藥血漿、滅活含藥血清、滅活含藥血漿與空白組比較有顯著差異(P＜0.05)。
　　 4.園丁糖20%濃度滅活含藥血清對(duì)鼻咽癌細(xì)胞PAR-2表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　 園丁糖20%濃度滅活含藥血清處理CNE-1細(xì)胞后PAR-2 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組比較顯著降低。
　　 [結(jié)論]
　　 HPLC法同時(shí)測定