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文檔簡介
1、本研究利用穩(wěn)定轉染方法在馬丁達比犬腎細胞(MDCK)中穩(wěn)定表達人寡肽轉運體1(hPEPT1),在mRNA水平、轉運體的活性水平進行了驗證;并將該穩(wěn)轉細胞模型用于中藥單體hPEPT1潛在抑制劑/底物的篩選,發(fā)現(xiàn)多個對hPEPT1具有抑制作用的單體化合物。
目的:構建穩(wěn)定表達hPEPT1的MDCK細胞模型(MDCK-hPEPT1),應用該模型篩選中藥單體中hPEPT1潛在抑制劑/底物,為后續(xù)研究基于hPEPT1的藥物-藥物相互
2、作用,以及發(fā)現(xiàn)以hPEPT1為靶點的炎癥性腸病拮抗劑提供參考。
方法:構建重組質粒pcDNA3.1(+)-hPEPT1,將其轉染MDCK細胞,經G418篩選后有限稀釋法挑選單克隆細胞,通過PEPT1經典底物Glysar、β-Ala-Lys(AMCA)、Carnosine等驗證單克隆細胞中hPEPT1轉運活性,反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測hPEPT1的mRNA表達情況,從中篩選出穩(wěn)定高表達hPEPT1的單克隆細胞
3、。將篩選出的活性好的單克隆細胞用于中藥單體中hPEPT1潛在配體的篩選,以中藥單體對Glysar攝取的抑制作用為表征,從中選出抑制作用較強的馬兜鈴酸A、新狼毒素B、水飛薊賓,測定它們作用于Glysar攝取轉運動力學參數(shù),同時利用Caco-2細胞模型進一步驗證這三種化合物對Glysar攝取和轉運的抑制作用。
結果:經有限稀釋法獲得的單克隆細胞通過底物β-Ala-Lys(AMCA)和Glysar驗證后,獲得兩株轉運活性較好的單
4、克隆細胞,這兩株細胞中hPEPT1的mRNA表達水平顯著高于轉染空載體pcDNA3.1(+)的細胞;已知的hPEPT1抑制劑(底物)顯著減少單克隆細胞對Glysar的攝取。將獲得的活性最好的單克隆細胞用于中藥單體篩選,發(fā)現(xiàn)部分中藥單體能較大程度程度抑制Glysar的攝取。其中,馬兜鈴酸A、新狼毒素B、水飛薊賓對Glysar攝取的IC50分別為4.1μmol·L-1,22.4μmol·L-1,250.1μmol·L-1;上述三個化合物在單
5、克隆細胞和轉染空載體細胞中的攝取無差異;無抑制劑存在時,單克隆細胞攝取Glysar的Km和Vmax分別為0.75mmol·L-1、0.32 nmol·mg protein-1·min-1,在馬兜鈴酸A、新狼毒素B、水飛薊賓存在時,Km和Vmax分別變?yōu)?.99 mmol·L-1、0.94 mmol·L-1、0.81 mmol·L-1和0.25nmol·mg protein-1·min-1、0.24 nmol·mg protein-1·m
6、in-1、0.18 nmol·mg protein-1·min-1。馬兜鈴酸A、新狼毒素B、水飛薊賓對Caco-2細胞攝取Glysar呈現(xiàn)濃度依賴性抑制,三個化合物均能降低Glysar在Caco-2細胞中的跨膜轉運。
結論:本研究成功構建了MDCK-hPEPT1細胞模型,該模型能用于PEPT1底物及抑制劑的高通量篩選;利用該模型篩選獲得多種對hPEPT1具有一定抑制作用的中藥單體,其中,馬兜鈴酸A、新狼毒素B、水飛薊賓經驗
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