寡肽-組氨酸轉(zhuǎn)運體PHT2在炎癥病理過程中的調(diào)控和功能研究.pdf

1、寡肽轉(zhuǎn)運體POTs(proton-coupled oligopeptide transporters)是利用質(zhì)子的動力和負(fù)膜電位介導(dǎo)一系列短鏈肽和擬肽類物質(zhì)的細(xì)胞轉(zhuǎn)運膜蛋白，包括PEPT1，PEPT2，PHT1，PHT2和SLC15A5等家族成員。所有成員都被預(yù)測含有12個跨膜結(jié)構(gòu)域，且N端和C端朝向細(xì)胞質(zhì)。大多數(shù)的研究集中在PEPT1和PEPT2，它們分別主要表達(dá)在小腸和腎小管上皮細(xì)胞膜頂側(cè)，負(fù)責(zé)對寡肽類和肽類似藥物的攝取。相比于PE

2、PT1和PEPT2，PHT1和PHT2的研究報道較少，PHT1主要表達(dá)在腦和視網(wǎng)膜中，PHT2主要表達(dá)在肺、脾和胸腺中，二者均定位表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜，介導(dǎo)寡肽和組氨酸的轉(zhuǎn)運，其底物的進(jìn)一步相關(guān)信息鮮有報道。炎癥是機(jī)體對于有害物質(zhì)的刺激或有害環(huán)境（如感染和組織損傷）的適應(yīng)性反應(yīng)，是固有免疫的一種機(jī)制。炎癥反應(yīng)的觸發(fā)主要依賴于固有免疫系統(tǒng)受體對微生物的識別，這些受體包括toll樣受體(TLR)和核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)樣受體。多項研究

3、顯示，寡肽轉(zhuǎn)運體可能與炎癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。PEPT1可以介導(dǎo)細(xì)菌的肽類似產(chǎn)物L(fēng)-Ala-γ-D-Glu-meso-二氨基庚二酸(tri-DAP)和胞壁酰二肽(MDP)的轉(zhuǎn)運，從而激活NOD受體依賴的信號通路，導(dǎo)致促炎因子的釋放。PHT1被發(fā)現(xiàn)高表達(dá)于免疫細(xì)胞群中，并且通過Toll-like受體9(TLR9)和NOD1信號通路加劇腸炎的固有免疫應(yīng)答。PHT1還與糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機(jī)制相關(guān)聯(lián)，預(yù)示著PHT1在固有免疫系統(tǒng)中扮演著重

4、要角色。然而PHT2的生理作用和藥物相關(guān)性還存在很大的未知性。組織分布顯示，PHT2主要表達(dá)在肺、脾和胸腺等淋巴系統(tǒng)，且在巨噬細(xì)胞中表達(dá)顯著。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)，脂多糖(LPS)可以上調(diào)PHT2的表達(dá)，而不影響家族其他轉(zhuǎn)運體的表達(dá)，提示PHT2的表達(dá)和調(diào)控可能與炎癥相關(guān)，因此研究PHT2在炎癥病理過程中的調(diào)控和功能，可以更好地了解PHT2的生理功能，也為炎癥性疾病（如炎癥性腸炎）的發(fā)病機(jī)制和治療提供更多思路。本研究主要內(nèi)容包括：
　

5、?、抨U明PHT2在巨噬細(xì)胞和小鼠組織中的表達(dá)情況，并探討脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性炎癥對PHT2的調(diào)節(jié)作用。mRNA結(jié)果顯示，PHT2在J774A.1和THP-1巨噬細(xì)胞中表達(dá)較高。在小鼠的組織分布中，mRNA和蛋白結(jié)果均表明PHT2高表達(dá)于肺和脾臟組織中。我們發(fā)現(xiàn)LPS能使人巨噬細(xì)胞系THP-1和小鼠巨噬細(xì)胞系J774A.1中的PHT2表達(dá)上調(diào)2倍左右，且該現(xiàn)象能分別被NF-κB和MAPK信號通路的特異性抑制劑逆轉(zhuǎn)。在LPS誘導(dǎo)的小鼠

6、急性炎癥模型中，通過對小鼠脾臟中PHT2 mRNA和蛋白的檢測，結(jié)果與體外實驗結(jié)果相似，即LPS顯著上調(diào)了小鼠脾臟中PHT2的表達(dá)，且該上調(diào)作用亦能被NF-κB和MAPK特異性抑制劑逆轉(zhuǎn)。上述結(jié)果表明，PHT2高表達(dá)于巨噬細(xì)胞、小鼠免疫器官和肺中，LPS通過激活NF-κB信號通路和MAPK信號通路誘導(dǎo)PHT2表達(dá)。
　?、脐U述小鼠結(jié)腸組織和結(jié)腸免疫細(xì)胞中POTs的表達(dá)，并使用化學(xué)試劑誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型來表征POTs，特別是

7、PHT2，在結(jié)腸炎狀態(tài)下的調(diào)控和潛在作用。通過分離小鼠近端結(jié)腸、遠(yuǎn)端結(jié)腸、結(jié)腸上皮細(xì)胞、結(jié)腸固有層單核細(xì)胞群(LPMC)及亞型CD11b+巨噬細(xì)胞，考察POTs的mRNA和蛋白表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)僅PHT1和PHT2在結(jié)腸的LPMC中有蛋白表達(dá)，在結(jié)腸CD11b+巨噬細(xì)胞中未觀察到任何POTs的蛋白表達(dá)。此外，PHT1在LPMC中的表達(dá)較低，且在葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的近端和遠(yuǎn)端結(jié)腸中表達(dá)下調(diào)。相反，PHT2蛋白在結(jié)

8、腸中表達(dá)中等，并在DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的遠(yuǎn)端結(jié)腸和LPMC中表達(dá)上調(diào)。PEPT1蛋白在正常小鼠和結(jié)腸炎小鼠的各個結(jié)腸節(jié)段，細(xì)胞或亞型中均不表達(dá)。將分離的LPMC給予外源性刺激物L(fēng)PS、tri-DAP或MDP，以及PHT2的經(jīng)典底物組氨酸和肌肽，考察PHT2在LPMC免疫應(yīng)答中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是LPS還是tri-DAP或MDP，都不能引起LPMC顯著的免疫應(yīng)答，且加入的PHT2底物不能抑制LPS、tri-DAP或MDP上調(diào)的炎

9、癥因子。上述結(jié)果提示，外源性地給予LPMC炎癥刺激物，PHT2可能不參與其中的免疫應(yīng)答。
　　⑶考察PHT2的底物轉(zhuǎn)運功能，特別是考察細(xì)菌肽MDP和tri-DAP是否為PHT2的底物。PHT2在細(xì)胞內(nèi)定位于溶酶體膜，使其底物研究較為困難。為研究PHT2的轉(zhuǎn)運功能和底物特性，我們首先對hPHT2的蛋白序列進(jìn)行突變，將19和20位亮氨酸突變?yōu)楸彼?，破壞了定位表達(dá)在溶酶體膜的信號基序，使PHT2定位表達(dá)在細(xì)胞膜上。將構(gòu)建成功的pcDN

10、A3.1(+)-hPHT219，20AA-eGFP轉(zhuǎn)染至MDCK細(xì)胞，經(jīng)過篩選和驗證獲得穩(wěn)定表達(dá)人PHT2的MDCK-hPHT219,20AA細(xì)胞。利用該細(xì)胞考察了POTs相關(guān)底物，證明了Gly-sar、伐昔洛韋、Gly-gly-gly、頭孢羥氨芐是hPHT2的底物;5-ALA、卡托普利不是hPHT2底物;細(xì)菌肽MDP是PHT2底物，tri-DAP能夠徼弱地被PHT2轉(zhuǎn)運。并獲得了d3-L-Histidine、Gly-sar和伐昔洛韋的

11、積聚動力學(xué)參數(shù)，分別為1667±99，73.6+5.9，63.7±6.3(Vmax，pmol/mgprotein/min);73.75±14,428±88,5350±1200(Km,μM);22.6,0.17,0.012(Clint,Vmax/Km)。
　?、瓤疾霵HT2在MDP誘導(dǎo)的NOD2依賴的免疫應(yīng)答中的作用。我們將RAW264.7巨噬細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-musPHT2-his質(zhì)粒，過表達(dá)PHT2蛋白。給予上

12、述細(xì)胞和對照組細(xì)胞MDP或LPS刺激，分別從mRNA水平和蛋白水平考察促炎因子IL-6、TNFα和IL-1β的表達(dá)，結(jié)果顯示，過表達(dá)PHT2蛋白能夠顯著上調(diào)MDP誘導(dǎo)的促炎因子表達(dá)，但不影響LPS誘導(dǎo)的促炎因子表達(dá)，提示PHT2極可能是通過其轉(zhuǎn)運功能加劇MDP誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。我們還考察了MDP對PHT2的調(diào)控作用，RAW264.7巨噬細(xì)胞給予不同濃度的MDP刺激以及不同時間的MDP刺激，PHT2的表達(dá)均顯著上調(diào)，但未發(fā)現(xiàn)PHT1表達(dá)變化