腫瘤壞死因子-α對原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞β3-腎上腺素能受體表達(dá)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 膿毒癥時，體內(nèi)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平明顯升高，并對心臟產(chǎn)生負(fù)性肌力作用；而β3-腎上腺素能受體（β3-AR）表達(dá)亦明顯增高，對心臟起負(fù)性肌力作用，與膿毒癥心功能障礙有關(guān)。已有研究顯示：TNF-α處理心肌細(xì)胞后，β-腎上腺素能受體（β-AR）（含β1-、β2-、β3-AR）正性肌力作用明顯減低；而感染后，血中TNF-α的水平明顯升高，加入TNF-α抑制劑可在一定程度上抑制心肌收縮力的下降。同時，有研究顯示

2、：全身感染的患者體內(nèi)一氧化氮（NO）水平明顯增加，TNF-α可刺激心臟組織合成釋放NO，導(dǎo)致心肌受抑，并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，且可以降低心肌細(xì)胞β-腎上腺素能受體反應(yīng)性；而抑制NO后，心肌正性肌力作用增強(qiáng)，可見NO參與β-AR系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。因此，我們設(shè)想：TNF-α?xí)险{(diào)心肌β3-AR而產(chǎn)生負(fù)性肌力作用，并抑制心肌收縮，導(dǎo)致心功能障礙；而NO會參與此過程，影響TNF-α對β3-AR的調(diào)節(jié)。
　　 方法：
　　 1、取生后2天S

3、D大鼠，麻醉，消毒，開胸，取心，沖洗，取心室肌，剪碎。用胰酶及膠原酶消化，收集上清離心，加培養(yǎng)基將沉淀吹打均勻，差速貼壁兩次，去除成纖維細(xì)胞，將未貼壁的細(xì)胞懸液放入培養(yǎng)瓶，隔日換液。行心肌細(xì)胞鑒定。
　　 2、取第四天細(xì)胞進(jìn)行實驗：1）加入含不同濃度TNF-α的培養(yǎng)液；2）加含L-NAME及含1.6ng/mlTNF-α的培養(yǎng)液，作用12小時。然后，收取心肌細(xì)胞，待用。
　　 3、real-time RT-PCR檢測心肌細(xì)

4、胞β3-AR mRNA：按試劑盒說明操作提取總RNA；進(jìn)行PCR擴(kuò)增；根據(jù)熒光定量分析圖，利用2-△△CT方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　 4、Western blot檢測心肌細(xì)胞β3-AR蛋白表達(dá)：蛋白提取及定量；SDS-PAGE蛋白電泳；進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體雜交；ELC發(fā)光
　　 結(jié)果：
　　 心肌細(xì)胞受TNF-α刺激后，β3-AR mRNA及蛋白水平變化一致：
　　 1、隨著TNF-α作用時間的延長、作用濃

5、度的增加，心肌細(xì)胞β3-AR mRNA和蛋白的相對表達(dá)量增加，至作用濃度為1.6ng/ml，作用時間為12小時，其表達(dá)量達(dá)峰值，后逐步減少。
　　 2、TNF-α作用于心肌細(xì)胞，濃度為1.6ng/ml，時間為12小時，L-NAME作用后β3-AR較作用前明顯降低，說明抑制NO合成后，β3-AR表達(dá)減少，也即NO參與TNF-α對心肌細(xì)胞β3-AR的表達(dá)的調(diào)節(jié)。
　　 結(jié)論：
　　 1、心肌細(xì)胞在TNF-α作用下，β