DNA修復蛋白Ku及BRCA1在視網膜神經細胞內沉默的分子機制.pdf

1、視網膜神經細胞的損傷包括諸多因素，但其最終的表現(xiàn)為神經元DNA損傷導致的細胞凋亡和細胞壞死。其中，DNA雙鏈斷裂(Double—strand breaks，DSBs)是DNA損傷最嚴重的一種形式。DNA的修復能力對于細胞保持其基因組的完整性具有非常重要的意義，若損傷的DNA無法得到及時、有效修復，將導致細胞死亡。非同源末端連接(DNA non—homologous end—joining，NHEJ)是神經元DSBs的主要修復方式，對神經

2、元的存活有很重要的意義。 Ku及BRCA1是DNA非同源末端連接修復的主要蛋白，在增殖細胞中起關鍵的修復作用；但在終末分化的神經元，兩者都沉默。近年來有研究提出，隨著中樞神經系統(tǒng)(CNS)發(fā)育成熟，DNA甲基化程度加強，某些基因啟動子區(qū)的CpG島發(fā)生甲基化，導致該基因沉默。因此，我們推測Ku及BRCA1沉默可能與其啟動子甲基化有關，進而導致神經元損傷時DNA斷裂不能及時有效修復?，F(xiàn)將本課題的研究目的、方法、結果和結論小結如下：

3、 研究目的： 1.探討視網膜神經細胞中Ku和BRCA1基因沉默的分子機制是否與其啟動子的甲基化有關； 2.探討視網膜神經細胞中Ku和BRCA1去甲基化后是否會影響其DNA修復能力。 研究方法： 1.原代培養(yǎng)SD乳鼠視網膜神經細胞，MAP2免疫熒光法鑒定神經細胞純度。0.5μM，1.0μM，2.0μM5-Aza—CdR(對照組不加5-Aza—CdR)處理，72小時后提取總RNA，RT—PCR檢測5-

4、Aza—CdR對Ku表達的影響。 2.原代培養(yǎng)SD乳鼠視網膜神經細胞，MAP2免疫熒光法鑒定神經細胞純度。0.5μM，1.0μM，2.0μM5-Aza—CdR(對照組不加5-Aza—CdR)處理，72小時后提取總蛋白檢測Ku的表達。 3.原代培養(yǎng)純化后的SD乳鼠視網膜神經節(jié)細胞。0.5μM，1.0μM，2.0μM5-Aza—CdR(對照組不加5-Aza—CdR)處理，72小時后倒置顯微鏡下進行拍照，比較不同組間神經節(jié)細胞

5、突起長度的差異。 4.原代培養(yǎng)純化后的SD乳鼠視網膜神經節(jié)細胞，5-Aza—CdR處理72小時，然后無血清培養(yǎng)6小時，再恢復完全培養(yǎng)液，提取DNA，檢測DNA的完整性。 5.Real time PCR進一步檢測5-Aza—CdR對原代培養(yǎng)純化后的SD乳鼠視網膜神經節(jié)細胞BRCA1表達的影響。 6.提取原代培養(yǎng)視網膜神經節(jié)細胞的DNA通過甲基化敏感性限制性內切酶PCR法檢測BRCA1啟動子的甲基化情況。 結

6、果： 1.原代培養(yǎng)SD乳鼠視網膜細胞，MAP2免疫熒光法鑒定神經細胞純度，所培養(yǎng)視網膜細胞中，MAP2陽性細胞87％。 2.RT—PCR檢測表明，5-Aza—CdR處理的視網膜神經細胞中，Ku的mRNA表達較對照組有明顯增加。 3.Western Blot檢測顯示，5-Aza—CdR處理的視網膜神經細胞中Ku蛋白的表達較對照組有明顯增加。 4.普通光鏡下觀察純化后的SD乳鼠視網膜神經節(jié)細胞，經5-Aza—

7、CdR處理組的軸突長度較對照組縮短。 5.DNA電泳結果顯示，5-Aza—CdR促進視網膜神經節(jié)細胞DNA的修復，染色體DNA更完整，斷裂的DNA較對照組明顯減少。 6.Real time PCR檢測顯示，加入5-Aza—CdR處理的視網膜神經細胞節(jié)BRCA1mRNA的表達較對照組明顯增加。 7.DNA酶切及PCR驗證了視網膜神經節(jié)細胞BRCA1的啟動子中兩個HapⅡ的酶切位點發(fā)生了甲基化。 結論：