腫瘤抗原OVA66體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)及其致瘤機(jī)制初探.pdf

1、OVA66是本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用重組cDNA表達(dá)文庫(kù)血清學(xué)分析(SerologicalanalysisofrecombinantcDNAexpressionlibrary,SEREX)方法從人卵巢癌cDNA文庫(kù)篩選得到的一個(gè)新的卵巢癌相關(guān)基因，其編碼蛋白被證明是一種新的腫瘤相關(guān)抗原，但其生物學(xué)功能及作用機(jī)制尚不明確。本研究擬在前期工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索OVA66基因及其編碼蛋白的致瘤性及在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的作用機(jī)制。論文由以下三部分工作組

2、成。
　　第一部分:抗OVA66單克隆抗體的制備及其特性研究
　　由于OVA66系我們實(shí)驗(yàn)室首次發(fā)現(xiàn)，目前市場(chǎng)上尚無商業(yè)化的相關(guān)抗體出售，因此給我們進(jìn)一步的研究工作，包括細(xì)胞定位、蛋白檢測(cè)等造成不便。為此，本部分實(shí)驗(yàn)首先從兩株穩(wěn)定分泌OVA66抗體的雜交瘤細(xì)胞中制備、純化和鑒定了兩種抗OVA66單抗5F4和4G9，證實(shí)均具有較高效價(jià)和特異性，為第二和第三部分研究奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分:OVA66的致瘤性及其參與腫瘤

3、發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制
　　第一章轉(zhuǎn)染OVA66基因的NIH3T3細(xì)胞體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)
　　將構(gòu)建的真核表達(dá)載體pFLAG-OVA66轉(zhuǎn)染至低表達(dá)OVA66基因的無致瘤性小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3中，經(jīng)G418篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)株NIH3T3OVA66。然后將此穩(wěn)定高表達(dá)OVA66基因的NIH3T3細(xì)胞株，在裸鼠體內(nèi)構(gòu)建實(shí)體瘤模型。經(jīng)免疫組化和活體熒光成像實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè)，移植瘤表達(dá)OVA66，證明構(gòu)建成功;同時(shí)在成瘤小鼠肺部組織亦檢

4、測(cè)到OVA66蛋白表達(dá)。從功能上證實(shí)OVA66是一種具有致瘤能力的腫瘤相關(guān)基因，它與體內(nèi)腫瘤的發(fā)生和遷移密切相關(guān)。
　　第二章NIH3T3OVA66細(xì)胞體內(nèi)成瘤機(jī)制探討
　　通過微量吸管黏附頻率試驗(yàn)計(jì)算黏附頻率、免疫組化方法檢測(cè)成瘤小鼠腫瘤組織及腎癌患者腫瘤和癌旁組織中OVA66、Arg-1和COX2的表達(dá)水平，并從NIH3T3Mock和NIH3T3OVA66細(xì)胞中定位檢測(cè)XTP3TPA蛋白幾個(gè)方面，對(duì)NIH3T3OVA66

5、細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤機(jī)制進(jìn)行了探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NIH3T3OVA66細(xì)胞與腫瘤小鼠的巨噬細(xì)胞黏附能力顯著高于其他組，而NIH3T3Mock細(xì)胞與腫瘤和非腫瘤來源巨噬細(xì)胞的黏附能力無明顯差異，而兩種NIH3T3細(xì)胞與腫瘤來源的巨噬細(xì)胞的黏附能力總體上大于它們與正常巨噬細(xì)胞的黏附能力。小鼠腫瘤組織中OVA66蛋白表達(dá)增高，腎癌患者腫瘤組織的OVA66、Arg-1和COX2表達(dá)水平均顯著高于癌旁組織(P＜0.001);但腫瘤組織中OVA66的表

6、達(dá)與Arg-1和COX2的表達(dá)未見明顯相關(guān)性(P＞0.05);在NIH3T3OVA66和NIH3T3Mock兩種細(xì)胞的胞漿中均可檢測(cè)到XTP3TPA蛋白表達(dá)，但只在NIH3T3OVA66細(xì)胞的細(xì)胞核中該蛋白表達(dá)明顯增高。提示兩點(diǎn):(1)OVA66可能是通過改變細(xì)胞表面粘附分子的表達(dá)，從而影響其與腫瘤間質(zhì)細(xì)胞的相互作用;但這種作用可能并不涉及Arg-1和COX2的表達(dá)。(2)OVA66的致瘤作用可能與其誘導(dǎo)XTP3TPA蛋白向細(xì)胞核富集有

7、關(guān)。
　　第三部分:XTP3TPA在腫瘤組織中表達(dá)譜比較分析
　　XTP3TPA是新近發(fā)現(xiàn)的一種未知功能的基因。OVA66能夠誘導(dǎo)XTP3TPA蛋白向細(xì)胞核富集促使我們進(jìn)一步分析XTP3TPA與腫瘤發(fā)生間的關(guān)系。通過免疫組化法我們檢測(cè)了6種類型的人體腫瘤組織和正常組織中XTP3TPA的表達(dá)量及其蛋白定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，XTP3TPA在正常（癌旁）組織細(xì)胞中的表達(dá)水平很弱，且主要集中在胞漿中。而在癌組織細(xì)胞中，除了在細(xì)胞漿中表達(dá)外