p53修飾的腫瘤抗原致敏制備DC瘤苗及其抗腫瘤效應(yīng).pdf

1、目的:
　　觀察p53基因修飾、制備的樹突狀細(xì)胞(DC)瘤苗在體內(nèi)外的特異性殺瘤效應(yīng),探討通過基因修飾腫瘤抗原來提高DC瘤苗的抗腫瘤免疫效應(yīng)的可能。
　　方法:
　　1、野生型p53質(zhì)粒轉(zhuǎn)染黑色素瘤B16細(xì)胞,Real-time PCR和Western blot檢測(cè)p53轉(zhuǎn)染前、后的表達(dá);凍融法提取p53修飾的腫瘤抗原(p53-Ag),體外沖擊同基因Km小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞,制得DC瘤苗。
　　2、MTT法檢

2、測(cè)DC瘤苗對(duì)淋巴細(xì)胞的刺激增值效應(yīng)(MLR)及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)體外殺瘤效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)均設(shè)單純DC、B16-DC和p53-DC三組, MLR以DC為刺激細(xì)胞,脾淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞,CTL以致敏T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞,B16為靶細(xì)胞,作常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)和觀察。
　　3、背部皮下接種B16細(xì)胞復(fù)制實(shí)體瘤模型,荷瘤小鼠隨機(jī)分成B16組、DC組、B16-DC組和p53-DC組,另設(shè)一正常對(duì)照組。分別于接種后的第1、7、14d,分3次在瘤周注射

3、DC瘤苗,每3天測(cè)量一次腫瘤最大垂直長、短徑,計(jì)算瘤體球積和各組平均體積,描繪腫瘤生長曲線;第21d處死小鼠,取腫瘤組織和血液標(biāo)本,稱瘤重后計(jì)算各組平均瘤重,ELISA法檢測(cè)血清IL-12和IFN-γ含量變化。
　　結(jié)果:
　　1、p53質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的腫瘤細(xì)胞均有p53基因及產(chǎn)物的表達(dá),用該p53修飾的腫瘤抗原沖擊、制得的DC瘤苗完全符合成熟DC的形態(tài)特征;
　　2、DC瘤苗的體外效應(yīng)MLR:當(dāng)刺激/效應(yīng)細(xì)胞比值為1:4

4、0時(shí),三組刺激指數(shù)各為1.49、2.49和2.93,B16-DC組、p53-DC組明顯高于DC組(P均<0.05),p53-DC組也顯著高于B16-DC組(P<0.05);而比值為1:80時(shí),三組刺激指數(shù)雖有降低,但三組間差異的兩兩比較結(jié)果與1:40時(shí)相同(P均<0.05)。CTL:以效/靶比為1:20時(shí)的殺傷率最高,三組各為30.00％、37.89%和52.47%, p53-DC組和B16-DC組均顯著高于DC組(P<0.01),p5

5、3-DC組也顯著高于B16-DC組(P<0.01);而效/靶比為1:40時(shí),三組殺傷率(24.24%、35.92%和46.63%)略有降低,但三組間兩兩比較,差異均十分顯著(P均<0.01)。
　　3、DC瘤苗的體內(nèi)抑瘤效應(yīng)接種后的腫瘤生長曲線顯示,B16組小鼠成瘤最早,生長最快;DC組成瘤晚,生長緩慢;B16-DC組和p53-DC組則成瘤最晚,生長最慢,9天后瘤體僅米粒大,且大部分瘤體呈消退趨勢(shì)。21天時(shí),B16組平均瘤重為0.

6、453g,DC組為0.025g,而B16-DC組和p53-DC組幾乎取不到腫瘤組織,差異十分顯著(P<0.01)。病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),DC瘤苗治療組的腫瘤組織內(nèi)血管生成較少,有較多的淋巴細(xì)胞浸潤,細(xì)胞變性與壞死較多見。
　　4、ELISA檢測(cè)外周血細(xì)胞因子IL-12:各實(shí)驗(yàn)組血清IL-12含量均較B16組顯著升高(P<0.01),其中B16-DC組和p53-DC組明顯高于DC組(P<0.01), p53-DC組又顯著高于B16-DC組

7、(P<0.01)。IFN-γ:除DC組外,各實(shí)驗(yàn)組血清IFN-γ含量都較B16組顯著升高(P均<0.01),B16-DC組和p53-DC組均顯著高于DC組(P均<0.01),p53-DC組又明顯高于B16-DC組(P<0.05)。p53-DC組的IL-12和IFN-γ含量均最高。
　　結(jié)論:
　　1、p53基因修飾確能增強(qiáng)腫瘤抗原誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的能力,其修飾的DC瘤苗對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖刺激能力較未經(jīng)修飾的DC更強(qiáng)。