帕金森病發(fā)病機(jī)制中Wnt及其相關(guān)通路作用的研究.pdf

1、本研究分為四部分：
　　 第一部分：糖原合成酶-3β在1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氫吡啶致C57BL/6小鼠多巴胺能神經(jīng)元損傷模型不同腦的表達(dá)變化
　　 目的：探討糖原合成酶（Glycogen Synthase Kinase-3β，GSK-3β）在1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenvL-1，2，3，6-tetrahvdropvridine，MPTP）致C57BL/6小鼠多巴

2、胺能神經(jīng)元損傷模型中不同腦區(qū)不同時(shí)程的表達(dá)變化。
　　 方法：采用腹腔注射MPTP制備C57BL/6小鼠PD模型。40只雄性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為8組（n=5只）：對照組、MPTP0d組、MPTP1d組、MPTP2d組、MPTP4d組、MPTP7d組、MPTP14d組、MPTP21d組。在末次注射MPTP后的相應(yīng)時(shí)間將動物處死，Western blot法檢測腹側(cè)中腦、紋狀體、皮質(zhì)區(qū)磷酸化GSK-3β（phosphoryla

3、tedGSK-3β，p-GSK-3β）以及總GSK-3β的表達(dá)；免疫組化法檢測腹側(cè)中腦GSK-3β陽性細(xì)胞表達(dá)；免疫熒光法檢測腹側(cè)中腦GSK-3β和凋亡細(xì)胞的共定位表達(dá)。
　　 結(jié)果：MPTP 顯著增加了C57BL/6小鼠腹側(cè)中腦p-GSK-3β和總GSK-3β的水平，然而p-GSK-3β：總的GSK-3β比值降低，所以非磷酸化的GSK-3β是增高的。免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)總的GSK-3β在腹側(cè)中腦明顯升高。免疫熒光雙標(biāo)顯示GSK-3

4、β的增高與神經(jīng)元的凋亡有明顯的關(guān)系。MPTP對于紋狀體區(qū)與皮質(zhì)區(qū)GSK-3β及p-GSK-3β的表達(dá)均無明顯影響。
　　 結(jié)論：MPTP所致腹側(cè)中腦區(qū)GSK-3β蛋白表達(dá)增加可能與PD發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制有關(guān)。
　　 第二部分：β-catenin 在1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氫吡啶致C57BL/6小鼠多巴胺能神經(jīng)元損傷模型不同腦區(qū)的表達(dá)變化
　　 目的：探討β-catenin 在MPTP 致C57BL/6

5、小鼠多巴胺能神經(jīng)元損傷模型中不同腦區(qū)不同時(shí)程的表達(dá)變化。
　　 方法：采用腹腔注射MPTP制備C57BL/6小鼠PD模型。40只雄性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為8組（n=5只）：對照組、MPTP0d組、MPTP1d組、MPTP2d組、MPTP4d組、MPTP7d組、MPTP14d組、MPTP21d組。在末次注射MPTP后的相應(yīng)時(shí)間將動物處死，Western blot法檢測腹側(cè)中腦、紋狀體、皮質(zhì)區(qū)磷酸化β-catenin（phos

6、phorylatedβ-catenin，p-β-catenin）以及總β-catenin的表達(dá)；免疫組化法檢測腹側(cè)中腦β-catenin陽性細(xì)胞表達(dá)；免疫熒光法檢測腹側(cè)中腦β-catenin和Hochest33258的共定位表達(dá)。
　　 結(jié)果：MPTP 致傷顯著增加了C57BL/6小鼠腹側(cè)中腦總β-catenin的水平，然而p-β-catenin 并沒有明顯的改變。皮質(zhì)、紋狀體β-catenin的表達(dá)無明顯改變。免疫組化說明MP

7、TP 處理后第7天β-catenin 在腹側(cè)中腦區(qū)域發(fā)生了核轉(zhuǎn)位。免疫熒光雙標(biāo)也顯示MPTP 處理的第7天β-catenin的表達(dá)增高，并且發(fā)生了核轉(zhuǎn)移。
　　 結(jié)論：MPTP所致腹側(cè)中腦區(qū)β-catenin 蛋白表達(dá)增加可能與PD發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制有關(guān)。
　　 第三部分：胰島素樣生長因子-1對1-甲基-4-苯基吡啶離子致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)中AKT和WNT 通路的作用
　　 目的：研究胰島素樣生長因子-1（I

8、nsulin Like Growth factor-1，IGF-1）對1-甲基-4-苯基吡啶離子（1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+）致PC12細(xì)胞損傷保護(hù)作用中Akt/GSK-3β通路以及Wnt 通路的作用。
　　 方法：以250 μmol/L的MPP+損傷PC12細(xì)胞作為帕金森病細(xì)胞模型，實(shí)驗(yàn)分組如下：空白對照組、LY294002組、LiCl組、MPP+組、MPP++IGF-1組、MPP++Li

9、Cl組、MPP++IGF-1+LY294002組?？瞻讓φ战M、LY294002組、LiCl組、MPP+組、MPP++IGF-1組分別給予F12 培養(yǎng)基加血清、10 μmol/L的LY294002、20mmol/L的LiCl、250 μmol/L的MPP+、250 μmol/L的MPP++100nmol/L的IGF-1 處理；MPP++LiCl組先給予20mmol/L的LiCl，1h后給予250 μmol/L的MPP+處理；MPP++IG

10、F-1+LY294002組先給予10 μmol/L的LY294002，1h后給予250 μmol/L的MPP++100nmol/L的IGF-1 處理。孵育24h后采用MTT法檢測細(xì)胞存活率，吖啶橙(AO)/溴化乙啶(EB)雙染法檢測細(xì)胞凋亡；孵育15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h之后采用Western Blot免疫印跡法檢測Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin、p-β-catenin

11、蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：①M(fèi)PP+和IGF-1+MPP+均可以誘導(dǎo)p-Akt增加；加用LY294002后p-Akt表達(dá)降低。②應(yīng)用LY294002 拮抗了IGF-1對于PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。③ MPP+和IGF-1+MPP+均可以誘導(dǎo)p-GSK-3β增加；加用LY294002后p-GSK-3β表達(dá)降低。④應(yīng)用LiCl 拮抗了MPP+對于PC12細(xì)胞的損傷作用。⑤ MPP+和IGF-1+MPP+均未誘導(dǎo)β-catenin和p-β

12、-catnin的表達(dá)改變。
　　 結(jié)論：IGF-1對MPP+致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用是通過Akt/GSK-3β通路發(fā)揮作用，而不是wnt 通路。
　　 第四部分：胰島素樣生長因子-1對1-甲基-4-苯基吡啶離子致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)中ERk通路的作用
　　 目的：研究胰島素樣生長因子-1（Insulin Like Growth factor-1，IGF-1）對1-甲基-4-苯基吡啶離子（1-methyl-4

13、-phenylpyridinium，MPP+）致PC12細(xì)胞損傷保護(hù)作用中ERK通路的作用。
　　 方法：以250 μmol/L的MPP+損傷PC12細(xì)胞作為帕金森病細(xì)胞模型，實(shí)驗(yàn)分組如下：空白對照組、PD98059組、MPP+組、MPP++IGF-1組、MPP++IGF-1+PD98059組?？瞻讓φ战M、PD98059組、MPP+組、MPP++IGF-1組分別給予F12 培養(yǎng)基加血清、50 μmol/L的PD98059組、25

14、0 μmol/L的MPP+、250 μmol/L的MPP++100nmol/L的IGF-1 處理；MPP++IGF-1+PD98059組先給予50 μmol/L的PD98059，1h后給予250 μmol/L的MPP++100nmol/L的IGF-1 處理。孵育24h后采用MTT法檢測細(xì)胞存活率，吖啶橙(AO)/溴化乙啶(EB)雙染法檢測細(xì)胞凋亡；孵育15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h之后采用WesternBlot免疫