高遷移率族蛋白在魚藤酮誘導(dǎo)帕金森病模型中對α-synuclein聚集的調(diào)控作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：在魚藤酮（Rotenone，Rot）誘導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型中，探討高遷移率族蛋白(High mobility group box1，HMGB1)對α-synuclein（α-syn）聚集的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法：魚藤酮處理體外培養(yǎng)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）細(xì)胞株建立帕金森病細(xì)胞模型。免疫熒光法觀察Rot誘導(dǎo)下HMGB1的細(xì)胞內(nèi)定位，并用蛋白免疫印跡法及RT-PCR技術(shù)觀察不同濃度和作用時間的Rot處理后，細(xì)胞內(nèi)α-

2、syn表達(dá)量與HMGB1的關(guān)系；應(yīng)用免疫共沉淀法檢測α-syn與HMGB1之間的相互作用。進(jìn)一步轉(zhuǎn)染過表達(dá)HMGB1質(zhì)粒及siRNA-HMGB1質(zhì)粒到SH-SY5Y細(xì)胞中，用電鏡觀察HMGB1的表達(dá)變化對細(xì)胞自噬的影響；同時應(yīng)用免疫印跡和免疫共沉淀技術(shù)探究細(xì)胞內(nèi)HMGB1對自噬相關(guān)蛋白LC3、P62、Beclin1及其復(fù)合體表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：SH-SY5Y細(xì)胞在魚藤酮（1μmol/L）作用下穩(wěn)定表達(dá)α-syn，成功建立PD細(xì)

3、胞模型。Rot能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)HMGB1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移，伴隨固定濃度Rot（1μM）作用時間的延長（0、12h、24h、48h），細(xì)胞內(nèi)α-syn聚集明顯增多，細(xì)胞內(nèi)HMGB1含量也隨之升高，各時間點(diǎn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；不同濃度梯度的Rot（0、0.4μM、0.8μM、1μM、2μM）培養(yǎng)24h后，在1μM濃度作用范圍內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)HMGB1與α-syn呈濃度依賴型增長，各濃度組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在2μM

4、Rot作用24h后，α-syn仍保持較高水平，而HMGB1含量下降。免疫共沉淀提示HMGB1與α-syn在Rot誘導(dǎo)下形成復(fù)合體。在Rot作用下，細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)HMGB1提高了LC3Ⅱ、P62的表達(dá)量，并在電鏡下觀察到自噬體增多、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)紊亂；而降低細(xì)胞內(nèi)HMGB1的表達(dá)，LC3Ⅱ/I比值有所恢復(fù)、P62含量也降低。過表達(dá)的HMGB1在細(xì)胞損傷情況下抑制Beclin1表達(dá)，并可以介導(dǎo)Beclin1與Bcl-2的結(jié)合，導(dǎo)致Beclin1-