呼吸道合胞病毒感染小膠質(zhì)細胞活化Toll樣受體3、7介導炎性反應的初步研究.pdf

1、目的：探討呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染小膠質(zhì)細胞(BV2)后,Toll樣受體3(Toll-like receptor 3,TLR3)和Toll樣受體7(Toll-like 7 receptor,TLR7)水平的變化,初步研究TLR3和TLR7介導產(chǎn)生的下游炎性因子在神經(jīng)系統(tǒng)病毒感染中表現(xiàn)出的炎性反應,為臨床RSV感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)的預防和治療提供新的思路。
　　方法：(1)RS

2、V感染體外培養(yǎng)的BV2,免疫熒光法分12、24、和36h檢測RSV融合蛋白(F蛋白),觀察RSV是否可以感染BV2。
　　(2)分別于感染4、8、12、16、24、和36h收集細胞,以未感染細胞作為對照組。用Trizol提取細胞總RNA,半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測TLR3、TLR7的mRNA表達量的變化。
　　(3)免疫印跡法(Western-blot)檢測RSV感染4、8、12、16、24、和36h核轉(zhuǎn)

3、錄因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)蛋白水平的變化,以未感染細胞作為對照組。
　　(4)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測感染不同時間點細胞上清中TNF-α含量的變化,以未感染細胞作為對照組。
　　結(jié)果：(1)免疫熒光結(jié)果顯示,和陰性對照比較,RSV感染BV2后12、24、36h可見在DAPI染色對照的細胞部位均可以見FITC標記RSV-F蛋白的綠色熒光,而陰性對照未見。并且該熒光呈增強趨勢,有時間依賴

4、性,。
　　(2)RT-PCR法測定結(jié)果顯示,正常組中TLR3、TLR7mRNA轉(zhuǎn)錄水平較低,而在RSV感染組,隨著感染時間增加TLR3、TLR7mRNA轉(zhuǎn)錄水平不斷提高。感染后4、8、12、16、24、36h不同時點感染組TLR3、TLR7mRNA轉(zhuǎn)錄水平均高于正常組,差異均有統(tǒng)計學意義,且在感染組中TLR3、TLR7mRNA轉(zhuǎn)錄水平有隨時間延長而呈升高趨勢,各時點間差異有統(tǒng)計學意義。
　　(3)Western blot法

5、測定結(jié)果顯示,正常組中NF-κB蛋白水平表達量較低,而在RSV感染組,隨著感染時間增加NF-κB表達不斷上調(diào)。感染后4、8h升高未見統(tǒng)計學意義,而從12、16、24、36h,各時點感染組NF-κB蛋白表達水平均高于正常組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01),且在感染組中,NF-κB蛋白表達水平有隨時間延長而呈升高趨勢,各時點間差異有統(tǒng)計學意義。
　　(4)ELISA法的檢測結(jié)果顯示,正常組中TNF-α含量較低,而在RSV感染組,隨