呼吸道合胞病毒分離鑒定及感染乳鼠模型的研究.pdf

1、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是嚴(yán)重危害嬰幼兒健康的最常見呼吸道感染病原體。我國RSV發(fā)病的高峰季節(jié)主要是冬春季，首次感染多發(fā)生在1歲以內(nèi)的嬰幼兒，尤其是2-6個月的嬰幼兒，感染后常引起嬰幼兒細(xì)支氣管炎和支氣管肺炎等下呼吸道疾病，多表現(xiàn)為咳嗽、憋喘、高熱，甚至呼吸困難、心力衰竭導(dǎo)致死亡，給人類健康和生命安全造成了嚴(yán)重威脅，由此，WHO提出RSV的防治成為全球首要任務(wù)之一。到目前為止，還沒

2、有安全有效的疫苗批準(zhǔn)上市，而其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，缺乏快速靈敏的檢測方法，沒有模擬人體 RSV感染的高致病性病毒株建立理想動物模型是造成這種現(xiàn)狀的主要原因。本論文基于 RSV研究沒有高致病性臨床株及理想動物模型的現(xiàn)實問題，開展了呼吸道合胞病毒分離鑒定及其感染乳鼠模型的研究，以期為RSV疫苗與治療藥物的有效性評價及致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。
　　目的：建立實時熒光定量PCR快速檢測RSV感染體系，利用Hep-2細(xì)胞分離鑒定臨床RSV高致

3、病性強(qiáng)毒株并建立動物模型，為藥物、疫苗的評價及致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：利用RSVA2的F基因構(gòu)建RSV A2質(zhì)粒，建立實時熒光定量PCR快速檢測RSV A感染體系，并評價其敏感性、重復(fù)性及特異性。收集臨床呼吸道感染重癥患兒的鼻咽分泌物樣本進(jìn)行實時熒光定量 PCR快速檢測，進(jìn)而采用流式CBA測定患兒血清中細(xì)胞因子的變化。陽性臨床樣本通過Hep-2細(xì)胞分離培養(yǎng)，空斑純化，電鏡、RT-PCR及 WB鑒定，獲得RSV臨床分離株

4、。測定RSV臨床分離株毒力，并感染14日齡 C57乳鼠，通過觀察體質(zhì)量及死亡率的變化篩選 RSV高致病性強(qiáng)毒株。采用RSV高致病性強(qiáng)毒株感染乳鼠，通過檢測乳鼠體質(zhì)量、死亡率，感染后1，3，5，7天肺組織的病毒載量、濕干比，病理、炎性細(xì)胞總量及血清中細(xì)胞因子的變化，建立RSV感染乳鼠模型。
　　結(jié)果：100份臨床呼吸道感染重癥患兒鼻咽分泌物樣本中，實時熒光定量PCR鑒定為RSV A亞型陽性共21例。流式CBA檢測陽性血清發(fā)現(xiàn)IL-6

5、、G-CSF、GM-CSF、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β均較正常血清有顯著性升高，而IFN-γ則顯著性降低。21例陽性臨床樣本經(jīng)病毒分離培養(yǎng)、空斑純化、電鏡、RT-PCR及WB鑒定后得到16株RSV臨床分離株。通過測定16株RSV臨床分離株的毒力，并將其感染 C57乳鼠，觀察乳鼠體質(zhì)量及死亡率變化，篩選出一株能致死14日齡C57乳鼠的RSV高致病性強(qiáng)毒株。經(jīng)全基因組測序后，構(gòu)建 RSV進(jìn)化樹顯示其為 A型 NA1基因型，命名為

6、 BJ016。將 BJ016傳代培養(yǎng)，毒力呈逐漸升高趨勢，到第8代趨于穩(wěn)定達(dá)108.5 TCID50/ml，將毒力穩(wěn)定后的 BJ016感染乳鼠后，乳鼠體質(zhì)量下降，死亡率達(dá)到60％，感染后第5，7日乳鼠肺組織病毒載量、濕干比及炎性細(xì)胞總數(shù)均較對照組具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異，肺組織病理在第3日出現(xiàn)病變，第5日最嚴(yán)重。感染后乳鼠血清中IL-6、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β水平變化與臨床患兒血清中細(xì)胞因