Toll樣受體3介導病毒促進垂體瘤增殖侵襲的機制研究.pdf

1、背景和目的:垂體瘤占顱內腫瘤約15％，其組織學為良性，但是有25-55％的垂體瘤朝周圍結構浸潤，比如鞍隔的骨性組織，篩竇和/或海綿竇等，這些垂體瘤稱為侵襲性垂體瘤。垂體瘤的侵襲性常與高Ki-67指數(shù)，并與嚴重的癥狀、更差的預后、高復發(fā)率、以及藥物替代治療的低反應性相關?，F(xiàn)有的研究已表明，染色體、基因(如:11p/q，p53)，粘附分子（如:E-cadherin），金屬基質蛋白（如:MMP2，MMP8），炎癥因子（如:IL-6，IL-17

2、）的異常變化與垂體瘤的進展、侵襲相關。但評估、解釋其侵襲性的特異性的組織學和分子生物學標準卻依然缺乏。不僅如此，現(xiàn)有的研究多從垂體瘤自身基因、轉錄、轉錄后修飾等幾個層面上的異常變化探索其侵襲性的來源，極少研究聚焦于外界環(huán)境如微生物感染等對垂體瘤發(fā)生發(fā)展的影響。
　　15-20％的人類腫瘤都與促腫瘤病毒相關。促腫瘤病毒促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的一重要機制是慢性感染常導致氧化應激與炎癥，受感染的細胞分泌炎癥因子如IL-1β、IL-6及TNF-

3、α，形成炎癥環(huán)境（inflammatory milieu），炎癥刺激、影響、激活NF-κB、STAT3及MAPKs等信號通路促進腫瘤的發(fā)展。近年的研究發(fā)現(xiàn)，模式識別受體(PRRs)不僅表達在免疫細胞，還能在腫瘤細胞中有表達。PRRs中最常見的是Toll樣受體(TLR)家族，其家族的多個成員如TLR2，TLR3，TLR4等均已證實在某些腫瘤中表達，且參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，其中與病毒感染最為密切相關的是TLR3。各種來源雙鏈RNA(dsRN

4、A)，壞死細胞來源或相關的RNA和人工合成的Poly(I∶C)均是TLR3的配體。病毒雙向轉錄過程中形成的dsRNA可激活TLR3，這與病毒類型（DNA病毒、RNA病毒等）無關。
　　已有大量的研究表明，高危HPV16被發(fā)現(xiàn)與人類多種腫瘤發(fā)生相關，包括宮頸癌、口咽癌、肛門癌以及頭頸部癌等。不僅如此，某些腫瘤中HPV16陽性的腫瘤細胞可更多朝周圍結構侵襲，以及更遠處的遷移。HHV6是嗜B淋巴細胞病毒，與兒童淋巴瘤患者的預后密切相關。

5、而HSV1則與乳腺癌病人總體存活率相關，并且與吸煙、飲酒、HPV感染等因素綜合決定頭頸部癌的發(fā)生。在垂體瘤中，尚未有報道其發(fā)生發(fā)展與某種病毒感染有關，因此，本研究擬檢測侵襲性與非侵襲性垂體瘤中前述三個促腫瘤病毒（HPV16，HSV1以及HHV6B）的感染情況，探討病毒感染與垂體瘤侵襲、增殖之間的關系。并且在體外垂體瘤細胞系中，探索病毒作用的分子機制，為臨床上預估、治療侵襲性垂體瘤提供新的思路。
　　方法:
　　1.利用免疫組

6、織化學、巢式PCR等技術，研究HPV16、HSV1、HHV6B DNA、病毒蛋白在垂體瘤病人病理標本中的表達。
　　2.利用qRT-PCR以及免疫組織化學的方法檢測垂體瘤病人病理標本中TLR3mRNA以及蛋白水平的表達。
　　3.利用大鼠垂體瘤細胞系GH3細胞系在體外探究TLR3對細胞侵襲、增殖能力的影響以及分子機制探究。
　　結果:
　　1.HPV16和HHV6B在侵襲性垂體瘤標本中感染率更高
　　60例

7、垂體瘤標本中，HPV16在侵襲性垂體瘤陽性檢測率為70％，非侵襲性垂體瘤陽性檢測率為26.67％，侵襲性垂體瘤組中HPV16的陽性檢測率顯著高于非侵襲性組(P＜0.01); HHV6B在侵襲性垂體瘤中的陽性檢測率為55.33％，在非侵襲性垂體瘤中陽性檢測率為23.33％，兩者之間差異顯著(P＜0.05); HSV1在侵襲性垂體瘤的檢出率為50％，非侵襲性垂體瘤檢出率為30％，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。因此，HPV16、HHV6B

8、感染與垂體瘤的侵襲性正相關，而HSV1的感染與垂體瘤侵襲性無關。
　　2.TLR3的mRNA與蛋白在侵襲組中表達均顯著高于非侵襲性PA組，且與HPV16、HHV6B感染率正相關。
　　在mRNA水平上，我們檢測了侵襲性垂體瘤組與非侵襲性垂體瘤組中與病毒感染相關的TLRs中的TLR3、4、7、8、9的表達，我們的結果發(fā)現(xiàn)，僅TLR3在侵襲性與非侵襲性組之間有差異(P＜0.01)。在侵襲組中，TLR3在mRNA水平上表達增加。緊

9、接著，我們又用免疫組化的方法檢測了TLR3蛋白水平的表達。TLR3的蛋白在每一例垂體瘤患者標本中均檢測出有表達，且TLR3表達在胞漿。通過對TLR3蛋白表達的定量統(tǒng)計，我們發(fā)現(xiàn)TLR3蛋白水平在侵襲性組顯著高于非侵襲性組(P＜0.01)。通過統(tǒng)計學方法分析TLR3表達量與HPV16、HHV6B感染率之間的關系，我們發(fā)現(xiàn)病毒感染率與TLR3表達之間呈正相關。
　　3.TLR3的激活可促進垂體瘤細胞系GH3的增殖
　　我們在8個

10、時間點上檢測了200μg/ml Poly(I∶C)對GH3細胞系的影響。生長曲線結果顯示，在分析的時間點內，Poly(I∶C)可以促進GH3細胞的增殖。
　　4.TLR3的激活可影響GH3細胞系的凋亡與細胞周期
　　Poly(I∶C)處理組與對照組對比可以發(fā)現(xiàn)，處理組中更少的凋亡細胞，更多的細胞處于細胞周期的S期?？沟蛲龅腂cl-2在Poly(I∶C)處理組中表達增加，促凋亡剪切活化的Caspase3在添加Poly(I∶C)

11、組中的表達更少。而促進凋亡的Bax蛋白在幾個處理組之間差異無統(tǒng)計學意義。與此同時，我們檢測了促進細胞從G1/G0期進入S期的蛋白Cyclin D1，我們發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1的表達在Poly(I∶C)處理組中增多。
　　5.TLR3的激活可促進GH3細胞的侵襲
　　在預先TLR3-siRNA預處理或未處理的Transwell上室中，加入Poly(I∶C)。48小時后，侵襲的細胞被染色和計數(shù)。統(tǒng)計分析顯示，Poly(I∶C)

12、處理組穿過上室的細胞更多。
　　6.TLR3下游的NF-κB被激活
　　我們運用免疫熒光的方法檢測了Poly(I∶C)刺激后NF-κB p65亞基的亞細胞定位。不僅如此，我們還分別檢測了p65分別在細胞漿、核中的表達水平。在Poly(I∶C)刺激24小時后，更多的p65轉移到了細胞核內，同時p65蛋白的表達水平在核內也是高于胞漿。
　　7.Poly(I∶C)刺激GH3后，下游腫瘤侵襲相關蛋白與炎癥因子的分泌增加。

13、>　　我們發(fā)現(xiàn)，GH3在Poly(I∶C)刺激后MMP9表達的增加，與體外研究一致，我們發(fā)現(xiàn)在人侵襲性PA病理標本中MMP9的表達水平高于非侵襲性組。NF-κB的激活可導致某些炎癥因子的分泌。Poly(I∶C)刺激GH3細胞后，可導致下游NF-κB的激活。因此我們檢測了NF-κB轉錄調控的炎癥因子IL-6，IL-1β與TNFα，三者在Poly(I∶C)干擾組中分泌均上調。
　　結論:
　　1.HPV16，HHV6B的感染率與