原發(fā)浸潤性膀胱移行細(xì)胞癌差異基因表達(dá)譜的建立及相關(guān)基因功能的初步研究.pdf

1、膀胱移行細(xì)胞癌(BTCC)的發(fā)生發(fā)展是一個涉及多基因的復(fù)雜過程，大量研究證實癌基因激活、抑癌基因的失活或表達(dá)缺失與其密切相關(guān)，浸潤、轉(zhuǎn)移是其最終治療失敗的主要原因，但具體發(fā)病機(jī)理至今不明。其次，全球范圍內(nèi)以老齡發(fā)病為主的BTCC，目前在我國卻以中老年居多且有較明顯的年輕化趨勢。此外，臨床常見的BTCC病理分期分級相似而預(yù)后明顯不同的現(xiàn)象，提示當(dāng)前高度依賴于病理學(xué)診斷結(jié)果的腫瘤分類方法不能準(zhǔn)確反映BTCC的生物學(xué)特性和惡性程度，從分子水平

2、進(jìn)行BTCC分子分型與早期分子診斷研究已成為一種必然趨勢。 基因芯片技術(shù)為基因組時代生物學(xué)研究提供了有利手段。利用基因芯片技術(shù)可通過對大量腫瘤組織的基因表達(dá)水平進(jìn)行全面、同步地量化檢測來高效篩選差異基因，在腫瘤研究領(lǐng)域是一個研究方法上的革命。目前利用基因表達(dá)譜對腫瘤進(jìn)行分類與診斷已形成共識。采用微陣列技術(shù)，即使組織學(xué)水平?jīng)]有顯著形態(tài)學(xué)改變，利用特異性基因表達(dá)譜芯片也可以對之做出早期診斷。但目前尚無有效的BTCC早期診斷、高危人群

3、篩查和預(yù)后預(yù)測標(biāo)記物，膀胱鏡加活檢、尿脫落細(xì)胞學(xué)、放射影像學(xué)仍是BTCC臨床診治、預(yù)后判斷的主要依據(jù)。研究基因表達(dá)譜與BTCC分型的相關(guān)性，尋找能夠早期發(fā)現(xiàn)浸潤性BTCC(muscleinvasiveBTCC，mBTCC)的特異性分子標(biāo)志物，能夠預(yù)測不同年齡的mBTCC個體實施非根治手術(shù)的遠(yuǎn)期風(fēng)險，指導(dǎo)治療時機(jī)、治療方式的選擇，以期改善針對不同實際病情的BTCC治療標(biāo)準(zhǔn)相對籠統(tǒng)的現(xiàn)狀，甚至能夠根據(jù)每一個BTCC病例其基因芯片所繪制的‘分

4、子圖譜’中基因表達(dá)水平的不同，制定出一個綜合治療方案，對于提高BTCC患者的臨床治愈率與生活質(zhì)量具有實際研究價值，對于從基因水平闡明BTCC的發(fā)病機(jī)理具有重要的理論意義。 由于BTCC具有多中心性、異質(zhì)性的特點，而復(fù)發(fā)性BTCC同時可能出現(xiàn)相關(guān)基因改變，故本課題以原發(fā)mBTCC患者為研究對象，選取每個根治性膀胱全切標(biāo)本中多個腫瘤病灶，利用人類基因表達(dá)譜芯片，以自體正常膀胱粘膜為對照，分別對青年及老年mBTCC組織的基因表達(dá)譜進(jìn)行

5、研究，尋找不同年齡患者原發(fā)mBTCC組織與自體正常膀胱粘膜組織的差異表達(dá)基因，以探討不同基因表達(dá)譜變化與不同年齡原發(fā)mBTCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。再采用RT-PCR方法，隨機(jī)對低齡/高齡組中不同差異表達(dá)的部分基因進(jìn)行驗證。依據(jù)基因芯片結(jié)果，選取在不同年齡mBTCC中表達(dá)均明顯升高的基因Uroplakin1a(Ratio：33/100)進(jìn)行初步的功能研究，為尋找有意義的BTCC分子標(biāo)記物和mBTCC的基因治療方案提供研究基礎(chǔ)，為下一步工作做好

6、準(zhǔn)備。 實驗的主要結(jié)果：1.選用8064點的人cDNA芯片，以自體正常膀胱粘膜組織為對照，以Ratio2/0.5為標(biāo)準(zhǔn)，低齡原發(fā)mBTCC組織的基因表達(dá)譜中，發(fā)生有意義表達(dá)變化的基因有1255條；高齡原發(fā)mBTCC組織的基因表達(dá)譜中，發(fā)生有意義表達(dá)變化的基因有2150條。以Ratio3/0.33為標(biāo)準(zhǔn)，分析發(fā)現(xiàn)低齡與高齡原發(fā)mBTCC組織中，一致性表達(dá)明顯上調(diào)的基因有168條，一致性表達(dá)明顯下調(diào)的基因有250條。這些基因的功能涉

7、及細(xì)胞代謝酶類、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞粘附因子、腫瘤相關(guān)基因、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子類、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、免疫系統(tǒng)成份、細(xì)胞表面抗原、轉(zhuǎn)錄因子類、離子通道及膜轉(zhuǎn)運蛋白、受體類、蛋白質(zhì)運輸、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、蛋白質(zhì)修飾系統(tǒng)、蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)、RNA加工運輸及降解、DNA修飾及染色體結(jié)構(gòu)蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、細(xì)胞膜結(jié)合蛋白、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)以及其他未分類基因等。 2.低齡與高齡原發(fā)mBTCC組織中，表達(dá)變化趨勢不同的基因有716條(Ratio2/0.5)

8、。其中表達(dá)變化趨勢明顯不同的基因有176條，存在明顯相反變化趨勢的基因有51條(Ratio3/0.33)，這些基因可能與不同年齡原發(fā)mBTCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)。 3.低齡與高齡原發(fā)mBTCC組織中，差異表達(dá)的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)有19條，其中一致性變化的EST有14條，表達(dá)變化趨勢不同的EST有5條。進(jìn)一步通過計算機(jī)克隆技術(shù)推演出這些EST所代表的cDNA全序列，有望發(fā)現(xiàn)與原發(fā)mBTCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的新基因。 4.低齡與高

9、齡原發(fā)mBTCC組織中，低齡組異常表達(dá)(Ratio3/0.33)、高齡組表達(dá)變化不明顯(Ratio0.8～1.2)的基因有42條，其中12條表達(dá)上調(diào)，30條表達(dá)下調(diào)，可能代表與低齡原發(fā)BTCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因。 5.在一致性表達(dá)明顯上調(diào)的基因中，分析發(fā)現(xiàn)了7條可能與mBTCC早期診斷相關(guān)的的分子標(biāo)志物。 6.RT-PCR隨機(jī)對不同差異表達(dá)的3條基因UP1a(Uroplakin1a)(Ratio：33/100)，Grow