膀胱移行細胞癌表達環(huán)氧化酶-2對腫瘤浸潤性樹突狀細胞功能影響的實驗研究.pdf

1、膀胱腫瘤是國內(nèi)泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其中90％以上是膀胱移行細胞癌(BTCC)，具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高等臨床特點。以往的研究認為腫瘤患者存在機體免疫功能低下、腫瘤局部浸潤性樹突狀細胞(TiDC)功能缺陷、腫瘤浸潤淋巴細胞活性及其對腫瘤的殺傷能力下降等現(xiàn)象，認為膀胱局部免疫功能低下可導(dǎo)致殘存腫瘤細胞逃逸免疫監(jiān)視并得以生存、發(fā)展，是膀胱腫瘤復(fù)發(fā)率高的主要原因，因此提出了腫瘤免疫抑制的“黑洞”理論。樹突狀細胞(dendriticcell，

2、DC)作為機體免疫反應(yīng)的始動細胞和調(diào)節(jié)細胞，具有激活CD8+CTL(細胞毒性T淋巴細胞)和CD4+T輔助細胞的能力，控制著機體內(nèi)免疫反應(yīng)的過程，是抗腫瘤免疫的中心環(huán)節(jié)。因此，研究BTCC組織中TiDC功能缺陷的具體機制對膀胱腫瘤治療和預(yù)防發(fā)具有重要意義。 環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)是合成各種前列腺素的關(guān)鍵酶。目前認為COX有兩種亞型：即COX-1和COX-2。COX-1屬于組成性酶，在多種組織中表達，參與維

3、持機體正常的生理活動。COX-2是誘導(dǎo)型酶，它可在多種細胞因子的作用下表達上調(diào)，參與機體的病理生理過程。研究表明COX-2在許多上皮來源性的惡性腫瘤組織中異常高表達，具有抑制細胞凋亡、降低機體免疫能力、促進腫瘤血管生成等多種功能，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。 目前國內(nèi)外對COX-2在膀胱腫瘤TiDC功能低下中的作用尚缺乏研究。本實驗在探討COX-2在BTCC中的表達情況前提下，對BTCC表達COX-2與TiDC功能變化之間

4、的相互關(guān)系進行了研究，實驗分兩部分進行。 第一部分COX-2在BTCC中的表達及其與BTCC生物學(xué)行為的關(guān)系目的：探討COX-2在BTCC中的表達及其與BTCC生物學(xué)行為的關(guān)系。 方法：應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測10例液氮保存的新鮮BTCC組織和10例腎移植供體正常膀胱組織標本的COX-2mRNA表達情況；采用免疫組織化學(xué)方法檢測72例BTCC組織標本和10例腦死亡供者正常膀胱組織標本的COX-2蛋白表達

5、。 結(jié)果：10例膀胱癌組織COX-2mRNA均呈陽性表達，10例正常膀胱組織僅有1例COX-2mRNA呈微弱陽性表達，余9例陰性；免疫組織化學(xué)顯示正常膀胱組織中未見COX-2蛋白明顯表達，但在BTCC組織中有不同程度的表達，COX-2的表達強度與腫瘤的分級、分期和復(fù)發(fā)相關(guān)(P＜0.05)，與腫瘤大小和腫瘤數(shù)目無關(guān)(P＞0.05)。 結(jié)論：COX-2在BTCC中呈異常高表達，COX-2的表達強度與腫瘤的分級、分期和復(fù)發(fā)等生

6、物學(xué)行為相關(guān)，提示COX-2可能在BTCC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 第二部分BTCC中的COX-2對腫瘤浸潤性樹突狀細胞表型和功能的影響目的：探討B(tài)TCC表達COX-2對腫瘤微環(huán)境中DC表型和功能的影響，了解其在BTCC免疫逃逸中發(fā)揮的作用，確定COX-2是膀胱腫瘤治療和預(yù)防的新靶標，為臨床應(yīng)用選擇性COX-2抑制劑治療和預(yù)防膀胱癌提供理論依據(jù)。 方法：1.用RT-PCR和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法分別檢測T24細

7、胞COX-2mRNA表達情況和其培養(yǎng)上清PGE2水平；觀察COX-2選擇性抑制劑Celebrex在不同濃度、不作用時間對T24細胞COX-2mRNA和PGE2表達的影響。 2.用淋巴細胞分離液梯度離心法分離人外周血單個核細胞，接種于含10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中，加入重組人粒巨細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重組人白細胞介素-4(rhIL-4)和T24細胞培養(yǎng)上清(或經(jīng)celebrex干預(yù)的T24細胞培養(yǎng)上清)體

8、外培養(yǎng)DC，以體外正常誘導(dǎo)組作為對照組，于第6天加入腫瘤壞死因子-α(TNF-α)促進DC分化成熟，于第9天收獲各誘導(dǎo)組DC及其培養(yǎng)上清，采用掃描電鏡、流式細胞術(shù)、同種異體混合淋巴細胞反應(yīng)等觀察DC形態(tài)學(xué)、表型和功能變化情況，ELISA法測定DC培養(yǎng)上清的IL-12水平。同時用T24細胞凍融抗原負載上述各組誘導(dǎo)培養(yǎng)的第6天DC，48小時后收獲DC并滅活用于刺激T淋巴細胞制備效應(yīng)細胞(CTL)，51Cr釋放試驗測定各組CTL對T24細胞的

9、殺傷活性，ELISA法測定效應(yīng)細胞培養(yǎng)上清的INF-γ水平。 主要結(jié)果：1.T24細胞COX-2mRNA呈陽性表達，其培養(yǎng)上清PGE2濃度為(2058.3±138.0)pg/(2×105cells.ml/24h)；Celebrex對T24細胞COX-2mRNA表達水平無明顯影響,Celebrex能有效抑制T24細胞分泌PGE2，60μmol/LCelebrex處理T24細胞24小時后其培養(yǎng)上清中PGE2濃度降至(782.0±69

10、.1)pg/(2×105cells.ml/24h)。 2.光鏡及掃描電鏡顯示各組DC均具有比較典型的樹突狀細胞形態(tài)。與正常對照組相比T24細胞培養(yǎng)上清對DC表面分子CD1a、CD83表達無明顯影響(P＞0.05)，但MHC-Ⅱ類分子HLA-DR和共刺激分子CD80表達率下調(diào)(P＜0.01)，DC的混合淋巴細胞反應(yīng)能力和IL-12分泌水平也明顯下降(P＜0.01)；而且T24細胞上清可使其培養(yǎng)DC誘導(dǎo)的效應(yīng)細胞分泌INF-γ能力下

11、降(P＜0.01)，以及降低對T24細胞特異性殺傷活性(P＜0.01)；外源性PGE2(500pg/ml)與T24細胞培養(yǎng)上清具有類似的效應(yīng)；而celebrex(60umol/L)處理T24細胞24小時后的培養(yǎng)上清則可阻滯DC的表型和功能抑制現(xiàn)象，但同時直接加入celebrex和T24細胞培養(yǎng)上清與DC共培養(yǎng)則沒有這種阻滯效應(yīng)。 結(jié)論：1.T24細胞培養(yǎng)上清不影響人外周血源性DC的形態(tài)學(xué)變化和成熟過程：T24細胞培養(yǎng)上清抑制了D

12、C表面分子HLA-DR和CD80的表達，使DC的抗原提呈能力和活化T細胞能力下調(diào)，無法有效誘導(dǎo)抗原特異性CTL反應(yīng)；同時T24細胞培養(yǎng)上清可使DC分泌IL-12水平明顯下降，使Th1/Th2平衡向Th2漂移，降低IFN-γ的分泌水平，抑制了Th1細胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫效應(yīng)。 2.上述的DC表型和功能變化是旁分泌PGE2造成的，用COX-2選擇性抑制劑Celebrex減少旁分泌PGE2水平可以阻滯DC表型和功能抑制現(xiàn)象。 全

13、文結(jié)論：1.COX-2在BTCC中呈異常高表達，其表達強度與腫瘤的病理分級、臨床分期及復(fù)發(fā)有關(guān)。 2.COX-2通過PGE2途徑引起膀胱腫瘤微環(huán)境中的TiDC表型和功能缺陷，從而抑制了DC抗原遞呈和誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗腫瘤免疫效應(yīng)的能力，上述改變是導(dǎo)致膀胱移行細胞癌發(fā)生免疫逃逸的重要機制之一。 3.Celebrex可通過抑制COX-2蛋白活性降低膀胱腫瘤局部微環(huán)境中的PGE2水平，改善TiDC表型和功能，這一結(jié)果為我們進一步探