hTrm61基因?qū)Π螂装?637細(xì)胞侵襲性的影響及基因芯片差異基因的初步探討.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、【背景和目的】
  在泌尿生殖系統(tǒng)中,膀胱癌是最為常見的惡性腫瘤,并且發(fā)病率逐年上升。2010年,僅僅在美國大約有70530名新的患者,并且有14680個患者死于膀胱癌。目前膀胱癌分型中,最常見的是移行細(xì)胞癌,鱗癌、腺癌,其他篩檢的分型僅占一小部分。膀胱癌已經(jīng)嚴(yán)重的影響了人們的工作和生活。一方面,在膀胱癌診斷、治療、復(fù)發(fā)監(jiān)測和治療相關(guān)并發(fā)癥的過程中需要昂貴的費用,給患者帶來巨大的經(jīng)濟(jì)壓力;另一方面,膀胱癌具有很高的復(fù)發(fā)率,相當(dāng)一部

2、分非肌層浸潤性膀胱癌在復(fù)發(fā)時,其分期和分級升高,并且約10%-20%發(fā)展成為肌層浸潤性膀胱癌,這時只能通過根治性膀胱全切和尿流改道術(shù)來治療。因此,盡早明確診斷和控制病情發(fā)展是膀胱癌治療中的關(guān)鍵所在。
  尿液修飾核苷是一種可靠的腫瘤標(biāo)記物,在多種腫瘤的早期診斷、病情評價和預(yù)后的評估方面具有十分重要的作用。我們之前的研究表明,m1A(1-甲基腺苷)和1-mel(1甲基次黃苷)聯(lián)合檢測具有很高的靈敏度(92.45%)和特異性(87.5

3、0%)。m1A58甲基轉(zhuǎn)移酶(hTrm6P/hTrm61P)是體內(nèi)產(chǎn)生 m1A的一種蛋白酶,它是一種異源四聚體,由兩個亞基組成。它能夠把tRNA58位的腺苷(A)催化成1-甲基腺苷(m1A)。
  我們前期研究中發(fā)現(xiàn),膀胱癌患者與正常人相比,其膀胱癌組織和尿液中的m1A水平均明顯升高。hTrm61基因是m1A58甲基轉(zhuǎn)移酶合成的必須基因之一,當(dāng)敲除hTrm61基因后,m1A的表達(dá)水平降低。并且在篩選出高表達(dá)hTrm61基因的563

4、7細(xì)胞株中,敲除hTrm61基因后,細(xì)胞的增殖受到抑制,凋亡增強(qiáng)。這說明hTrm61基因可能在膀胱癌的發(fā)病過程中有重要作用。
  本實驗在前一步的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究敲除hTrm61基因后5637細(xì)胞的侵襲能力的變化。把轉(zhuǎn)染hTrm61-siRNA的5637細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的5637細(xì)胞送檢做Affymetrix U133 plus2.0 array芯片分析,以分析敲除hTrm61基因后,基因表達(dá)譜的差異基因,以此來研究敲除hTrm

5、61后,可能影響到哪些信號通路。
  【方法】
  1、化學(xué)合成hTrm61-siRNA、無效序列siRNA(Negative control)。實驗分3組:實驗組、陰性對照組、空白對照組。利用lipo2000分別將hTrm61-siRNA和無效序列siRNA瞬時轉(zhuǎn)染至5637細(xì)胞株作為實驗組和陰性對照組,不作任何處理的5637細(xì)胞株作為空白對照組。轉(zhuǎn)染24h后,熒光定量PCR測定hTrm61基因的敲除效率;然后用TRANS

6、WELLL測定敲除hTrm61后,對5637細(xì)胞侵襲的影響。
  2、利用基因芯片檢測hTrm61-siRNA轉(zhuǎn)染至5637細(xì)胞株后相對于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的5637細(xì)胞株的基因表達(dá)譜的改變,篩選出差異基因,利用 PANTHER數(shù)據(jù)庫對這些差異基因進(jìn)行GO功能分析,并初步探究這些基因可能影響到那些通路
  【結(jié)果】
  1、空白組細(xì)胞穿膜數(shù)為:76±4.6,陰性對照組細(xì)胞穿膜數(shù)為:74±5.2,實驗組細(xì)胞穿膜數(shù)為:32±2.2

7、。陰性對照組和空白組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),實驗組和空白對照組相比差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
  2、基因芯片結(jié)果顯示:按差異差異(Foldchange)≥2.0倍或者≤0.5倍為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn),差異基因有2423個,其中上調(diào)的有1337個,下調(diào)的有1086個;若將差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)上調(diào)至5倍,則差異基因有419個,其中上調(diào)的有221個,下調(diào)的有198個。這些差異基因能夠影響到許多信號通路。
  【

8、結(jié)論】
  1、膀胱癌細(xì)胞株5637中敲除hTrm61基因,發(fā)現(xiàn)膀胱癌5637細(xì)胞株的侵襲能力變?nèi)酰f明hTrm61基因能夠增加細(xì)胞株5637的侵襲性。這提示我們hTrm61基因在膀胱癌的侵襲發(fā)生機(jī)制中可能起到重要作用。
  2、初步構(gòu)建沉默hTrm61基因的5637細(xì)胞相對于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的差異基因表達(dá)譜。
  3、利用基因芯片技術(shù),在敲除hTrm61基因組和空質(zhì)粒組對比中發(fā)現(xiàn)了多達(dá)上千個差異基因的表達(dá),這些差異基因涉

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