hTrm61基因?qū)Π螂装?637細(xì)胞侵襲性的影響及基因芯片差異基因的初步探討.pdf

1、【背景和目的】
　　在泌尿生殖系統(tǒng)中，膀胱癌是最為常見的惡性腫瘤，并且發(fā)病率逐年上升。2010年，僅僅在美國(guó)大約有70530名新的患者，并且有14680個(gè)患者死于膀胱癌。目前膀胱癌分型中，最常見的是移行細(xì)胞癌，鱗癌、腺癌,其他篩檢的分型僅占一小部分。膀胱癌已經(jīng)嚴(yán)重的影響了人們的工作和生活。一方面，在膀胱癌診斷、治療、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)和治療相關(guān)并發(fā)癥的過程中需要昂貴的費(fèi)用，給患者帶來巨大的經(jīng)濟(jì)壓力；另一方面，膀胱癌具有很高的復(fù)發(fā)率，相當(dāng)一部

2、分非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌在復(fù)發(fā)時(shí)，其分期和分級(jí)升高，并且約10％-20%發(fā)展成為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，這時(shí)只能通過根治性膀胱全切和尿流改道術(shù)來治療。因此，盡早明確診斷和控制病情發(fā)展是膀胱癌治療中的關(guān)鍵所在。
　　尿液修飾核苷是一種可靠的腫瘤標(biāo)記物，在多種腫瘤的早期診斷、病情評(píng)價(jià)和預(yù)后的評(píng)估方面具有十分重要的作用。我們之前的研究表明，m1A（1-甲基腺苷）和1-mel（1甲基次黃苷）聯(lián)合檢測(cè)具有很高的靈敏度（92.45%）和特異性（87.5

3、0%）。m1A58甲基轉(zhuǎn)移酶（hTrm6P/hTrm61P）是體內(nèi)產(chǎn)生 m1A的一種蛋白酶，它是一種異源四聚體，由兩個(gè)亞基組成。它能夠把tRNA58位的腺苷（A）催化成1-甲基腺苷（m1A）。
　　我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者與正常人相比，其膀胱癌組織和尿液中的m1A水平均明顯升高。hTrm61基因是m1A58甲基轉(zhuǎn)移酶合成的必須基因之一，當(dāng)敲除hTrm61基因后，m1A的表達(dá)水平降低。并且在篩選出高表達(dá)hTrm61基因的563

4、7細(xì)胞株中，敲除hTrm61基因后，細(xì)胞的增殖受到抑制，凋亡增強(qiáng)。這說明hTrm61基因可能在膀胱癌的發(fā)病過程中有重要作用。
　　本實(shí)驗(yàn)在前一步的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究敲除hTrm61基因后5637細(xì)胞的侵襲能力的變化。把轉(zhuǎn)染hTrm61-siRNA的5637細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的5637細(xì)胞送檢做Affymetrix U133 plus2.0 array芯片分析，以分析敲除hTrm61基因后，基因表達(dá)譜的差異基因，以此來研究敲除hTrm

5、61后，可能影響到哪些信號(hào)通路。
　　【方法】
　　1、化學(xué)合成hTrm61－siRNA、無效序列siRNA（Negative control）。實(shí)驗(yàn)分3組：實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組。利用lipo2000分別將hTrm61-siRNA和無效序列siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至5637細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組，不作任何處理的5637細(xì)胞株作為空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染24h后，熒光定量PCR測(cè)定hTrm61基因的敲除效率；然后用TRANS

6、WELLL測(cè)定敲除hTrm61后，對(duì)5637細(xì)胞侵襲的影響。
　　2、利用基因芯片檢測(cè)hTrm61-siRNA轉(zhuǎn)染至5637細(xì)胞株后相對(duì)于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的5637細(xì)胞株的基因表達(dá)譜的改變，篩選出差異基因，利用 PANTHER數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些差異基因進(jìn)行GO功能分析，并初步探究這些基因可能影響到那些通路
　　【結(jié)果】
　　1、空白組細(xì)胞穿膜數(shù)為：76±4.6，陰性對(duì)照組細(xì)胞穿膜數(shù)為：74±5.2,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞穿膜數(shù)為：32±2.2

7、。陰性對(duì)照組和空白組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組相比差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　2、基因芯片結(jié)果顯示：按差異差異（Foldchange）≥2.0倍或者≤0.5倍為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)，差異基因有2423個(gè)，其中上調(diào)的有1337個(gè)，下調(diào)的有1086個(gè)；若將差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)上調(diào)至5倍，則差異基因有419個(gè)，其中上調(diào)的有221個(gè)，下調(diào)的有198個(gè)。這些差異基因能夠影響到許多信號(hào)通路。
　　【

8、結(jié)論】
　　1、膀胱癌細(xì)胞株5637中敲除hTrm61基因，發(fā)現(xiàn)膀胱癌5637細(xì)胞株的侵襲能力變?nèi)?，說明hTrm61基因能夠增加細(xì)胞株5637的侵襲性。這提示我們hTrm61基因在膀胱癌的侵襲發(fā)生機(jī)制中可能起到重要作用。
　　2、初步構(gòu)建沉默hTrm61基因的5637細(xì)胞相對(duì)于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的差異基因表達(dá)譜。
　　3、利用基因芯片技術(shù)，在敲除hTrm61基因組和空質(zhì)粒組對(duì)比中發(fā)現(xiàn)了多達(dá)上千個(gè)差異基因的表達(dá)，這些差異基因涉