番荔枝內(nèi)酯類似物AA005的生物學(xué)效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、番荔枝內(nèi)酯是從番荔枝科植物中分離得到的一類具有廣譜生理活性的天然化合物，其具有抗腫瘤活性并且可能通過有效抑制哺乳動(dòng)物線粒體中NADH-泛醌-氧化還原酶（線粒體復(fù)合體Ⅰ）的活性而發(fā)揮作用。番荔枝內(nèi)酯類聚醚類似物（AA005），在綜合了天然化合物結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)的基礎(chǔ)上，合成更為簡單。目前，研究表明AA005能夠選擇性誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的死亡，但細(xì)胞死亡的機(jī)制和信號(hào)通路尚不明確，并且關(guān)于AA005其他生物學(xué)功能的研究也鮮見報(bào)道。本課題試圖通過對(duì)AA005

2、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的調(diào)控機(jī)制的研究，發(fā)掘AA005在細(xì)胞生命活動(dòng)中的新功能，主要取得了以下成果：
　?。?）AA005能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞死亡。發(fā)現(xiàn)微摩爾濃度AA005具有廣泛抗腫瘤效應(yīng)，不僅發(fā)生在實(shí)體瘤細(xì)胞，包括結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620，乳腺癌細(xì)胞株BT549，同時(shí)也發(fā)生在非實(shí)體瘤細(xì)胞，包括急性早幼粒白血病細(xì)胞株 NB4，急性單核細(xì)胞白血病U937細(xì)胞株。
　?。?）AA005通過AIF調(diào)控的Caspase-3非依賴的途徑誘

3、導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。檢測(cè)表明AA005誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡通過非典型的凋亡途徑，特征包括：缺乏Caspase-3的活化和凋亡小體的形成，細(xì)胞死亡過程中無顯著的Annexin-V+/PI-的早期凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，對(duì)caspase的廣譜抑制劑不敏感等。同時(shí)，AA005的抗腫瘤效應(yīng)與經(jīng)典烷化劑MNNG類似，在AA005誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的過程中AIF從線粒體釋放轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，并且PARP的抑制劑能夠阻斷AIF轉(zhuǎn)位，從而有效抑制AA005的抗腫瘤效應(yīng)。另外沉默表達(dá)

4、AIF也能在很大程度上抑制AA005引起的細(xì)胞死亡。進(jìn)一步地研究表明抗氧化劑NAC可以通過抑制AA005誘導(dǎo)早期產(chǎn)生的高ROS含量阻斷AA005引起的細(xì)胞死亡，并且受體相互作用蛋白激酶RIP-1可能受到氧化應(yīng)激的調(diào)控在AA005誘導(dǎo)的AIF依賴的細(xì)胞死亡過程中發(fā)揮了重要作用。
　?。?）低濃度的AA005能夠特異性抑制秀麗線蟲及小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1的脂質(zhì)生成。秀麗線蟲和3T3-L1細(xì)胞是研究脂質(zhì)生成最常用的兩種模型，用油紅O

5、染色定量脂肪含量的方法，發(fā)現(xiàn)納摩爾濃度的AA005在調(diào)控脂質(zhì)代謝方面的新的生物學(xué)效應(yīng)。
　　（4）利用化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)驅(qū)動(dòng)的RNAi技術(shù)找到AA005調(diào)控脂代謝的效應(yīng)靶蛋白HADHA。合成生物素標(biāo)記的AA005（Biotin-AA005），并以此為“誘餌”，利用化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)驅(qū)動(dòng)的秀麗線蟲成熟的feeding RNAi技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)35種Biotin-AA005互作的候選蛋白質(zhì)功能抑制后線蟲表型的逐一快速篩選和驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)只有T08B2

6、.7基因功能干擾后，明顯抑制線蟲的脂質(zhì)累積，與AA005處理線蟲后的表型一致，提示其可能是AA005抑制線蟲內(nèi)脂質(zhì)累積的靶標(biāo)蛋白。對(duì)應(yīng)于哺乳動(dòng)物的同源蛋白為線粒體三功能酶α亞基（HADHA）。在小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1中對(duì)沉默HADHA表達(dá)的效應(yīng)進(jìn)行了最終確認(rèn)。進(jìn)一步的分子動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明AA005與HADHA存在相互作用，并且具有較強(qiáng)結(jié)合力。另外，通過對(duì)線蟲或HepG2細(xì)胞進(jìn)行高糖或高脂誘導(dǎo)，觀察AA005處理或抑制HADHA功能后的

7、效應(yīng)，我們發(fā)現(xiàn)AA005很可能通過抑制HADHA的功能阻斷了以葡萄糖為原料合成脂肪酸的過程從而抑制脂質(zhì)累積。
　　綜上所述，本課題發(fā)現(xiàn)AA005通過AIF依賴的，Caspase-3非依賴的機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，第一次揭示了AIF在AA005作用機(jī)制中的調(diào)控作用，提示AA005可能作為一種AIF依賴的抗癌藥用于臨床治療，尤其針對(duì)caspase突變及對(duì)傳統(tǒng)凋亡誘導(dǎo)藥抵抗的癌癥。另外，我們發(fā)現(xiàn)了低濃度AA005在調(diào)控脂質(zhì)代謝方面的新的生物