胰島素類似物的生物制備.pdf

1、速效胰島素是一類通過(guò)基因工程方式獲得的單體胰島素,具有起效快,安全性高等優(yōu)點(diǎn),是新型胰島素類似物的一種。本論文通過(guò)基因工程方法制備兩種單體速效胰島素。
　　論文包括兩個(gè)部分,第一部分是利用內(nèi)含肽介導(dǎo)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備單體人胰島素B22D(B22D-DesB30-insulin);第二部分是利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)制備單體人胰島素B27K-DTrI前體B27K。人胰島素B22D是將人胰島素B鏈22位精氨酸突變?yōu)樘於彼岷蟮玫降木哂袉?/p>

2、體性質(zhì)的人胰島素類似物。我們采用pTWIN1-IMPACT表達(dá)系統(tǒng),經(jīng)過(guò)幾丁質(zhì)親和純化及內(nèi)含肽自身剪切獲得人胰島素B22D前體的方法,操作簡(jiǎn)單,快捷。
　　在實(shí)驗(yàn)中,我們摸索得到的最優(yōu)剪切條件是25℃,在不含尿素的緩沖液(pH5.5)中剪切6天。剪切反應(yīng)結(jié)束后,調(diào)節(jié)緩沖液pH至8.0繼續(xù)混合2小時(shí)可增加剪切液中人胰島素B22D前體的含量。前體蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶切(pH8.0,37℃,60min)獲得的產(chǎn)物通過(guò)HPLC純化及質(zhì)潛鑒定證

3、實(shí)為人胰島素B22D。最終,人胰島素B22D產(chǎn)量為0.621mg/LB27K-DTrI是2005年由丁金國(guó)等人利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)制備的速效人胰島素,具有單體性質(zhì)好,生物活性高等優(yōu)點(diǎn)。但由于B27Lys DTrI在畢赤酵母中表達(dá)量較低影響其進(jìn)一步的生產(chǎn)應(yīng)用。有研究表明胰島素前體的自身聚合性質(zhì)有利于前體的穩(wěn)定表達(dá),從而可以提高蛋白在酵母中的表達(dá)量。
　　我們利用單點(diǎn)突變的方法將胰島素B鏈27位替換為賴氨酸。這樣的設(shè)汁既保留了原有的B

4、鏈末端,又可以通過(guò)胰蛋白酶酶切的方式獲得B27K-DTrI。希望通過(guò)這一方法得到的B27Lys DTrI前體(B27K)在畢赤酵母中的產(chǎn)量能夠得到提高,達(dá)到最終獲取足夠的單體速效胰島素的目的。在工作中,我們篩選到了一株高拷貝、高表達(dá)的B27K菌株(S菌株)。對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn),得到了5L發(fā)酵罐的最優(yōu)培養(yǎng)條件為pH5.0,溫度25℃,誘導(dǎo)108小時(shí)。在優(yōu)化培養(yǎng)條件下,前體蛋白B27K表達(dá)量可達(dá)114mg/L,高于原有的B27K-DTr