MiR-918的加工調節(jié)機制及其在紅系分化中的功能研究.pdf

1、背景:造血過程是人體內各類血細胞的發(fā)育、成熟的過程。整個造血分化過程涉及到三個階段:第一個階段是造血干細胞(hemopieticstemcells)階段，這些造血干細胞能通過自我復制(selfrenewal)保持自身數(shù)量的穩(wěn)定，同時又可以分化發(fā)育形成各系的定向祖細胞(committedprogenitors);第二個階段是定向祖細胞階段，這個階段包括紅系祖細胞(CFU-E)、巨核系祖細胞(CFU-MK)、粒-單核系祖細胞(CFU-GM)

2、，和TB淋巴系祖細胞(CFU-TB);第三個階段是前體細胞(precursors)及其成熟階段，這一階段的細胞進一步分化成熟為具有各類特殊功能的終末血細胞，然后釋放進入外周血液。紅系分化是體內造血分化過程的重要分支。
　　miRNAs是一類具有18-25個核苷酸、非編碼的微小調節(jié)性的RNA分子，主要在轉錄后水平調控基因的表達，參與生命調控的各個方面，并與多種疾病的產生相關。研究發(fā)現(xiàn)microRNAs(miRNAs)也參與了紅系分化

3、的調控過程。
　　目的:本論文主要研究miR-918的加工調節(jié)以及在紅系分化中的作用機制。
　　方法:利用實時定量PCR(real-timePCR)篩選了一批與紅系分化相關的miRNA，分別針對這些miRNA的primary、precusor、mature形式設計引物，用以檢測在氯化血紅素(hemin)誘導的K562細胞向紅系分化過程中的表達變化，收集不同時間點的細胞，確定miR-918在紅系分化的表達變化。通過5'-rac

4、e實驗和3'-race實驗獲得pri-918的全長轉錄本，進一步利用RBPDB軟件隊pri-918全長進行分析，將候選RNA結合蛋白的si-RNA轉染到k562細胞中，hemin誘導向紅系分化，利用real-timePCR方法檢測miR-918primary和mature的表達變化。利用RNA-IP、RNA-EMSA、MS2-MBP實驗驗證QKI與miR-918的結合作用。
　　體外合成miR-918mimic，在細胞系中進行過表

5、達，hemin誘導，用real-timePCR方法檢測γ-globin的表達變化，用流式分析紅系分化的表面標記CD235a/CD71的表達表達。隨后在臍帶血來源的CD34+干細胞中利用慢病毒進行miR-918的過表達，用流式細胞術檢測相應變化。進一步構建可以降低QKI-5表達的質粒，轉染K562細胞，檢測r-globin的變化和紅系分化表面標記的變化。
　　利用軟件分析，找到miR-918的若干候選靶基因，將這些候選基因3'UTR

6、區(qū)包含miRNA結合位點的序列克隆入熒光素酶報告基因的下游，與miR-918mimic共轉染293TN細胞后檢測報告基因的表達情況，采用雙熒光實驗和westernblot實驗進一步驗證這些靶基因。
　　結果:miR-918在紅系分化過程中有表達，實驗證實RNA結合蛋白QKI-5和miR-918存在直接作用;過表達miR-918，使得hemin誘導的K562細胞中血紅蛋白合成受阻，紅系分化標志CD235a/CD71受到顯著抑制，表明

7、miR-918抑制紅系分化。在原代培養(yǎng)的CD34+干細胞中過表達miR-918得到的結果與上述細胞系中一致。而且，抑制K562細胞中QKI-5表達后促進紅系分化，表明QKI參與miR-918的加工成熟。
　　雙熒光實驗表明包含有TAL1和c-MYB基因3'UTR的報告基因的表達可以被miR-918明顯抑制;突變相應的結合位點序列，這種抑制作用消失。Westernblot也證實在K562細胞中過表達miR-918，TAL1和c-MY