PHF19在人肝細胞癌發(fā)病機制中的作用及其受MiR-195-5p調(diào)節(jié)的機制研究.pdf

1、目的：
　　本課題旨在研究和探討miR-195是否對PHF19有調(diào)控作用，闡述miR-195對HCC發(fā)生發(fā)展過程中分子生物學機制的影響，主要從細胞分子水平和動物整體水平觀察PHF19及調(diào)控其表達的miRNA對HCC的影響并探討其相關(guān)的機制，為尋找HCC新的治療靶點提供重要依據(jù)。
　　方法：
　　一、觀察HCC組織中PHF19的表達情況
　　1.首先收集30例臨床HCC癌癥組織和配對癌旁組織標本，選取癌旁組織為對照

2、組，癌組織為實驗組。對組織進行RNA提取，通過實時熒光定量PCR分別檢測30例人HCC癌組織和配對癌旁組織中PHF19 mRNA水平的表達。
　　二、觀察PHF19對肝癌細胞系的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響
　　1.通過構(gòu)建PHF19慢病毒過表達載體，并將載體轉(zhuǎn)染到肝癌細胞系HepG2細胞中，并利用蛋白印跡實驗(Western blot)對提取的細胞蛋白質(zhì)進行分析，驗證其慢病毒PHF19載體的轉(zhuǎn)染效果。
　　2.觀察的

3、實驗組與對照組的HepG2細胞通過Transwell膜的數(shù)量，觀察PHF19對肝癌細胞侵襲及遷移能力的影響。
　　3.利用CCK-8試劑處理鋪板于96孔板的LV-PHF19 HepG2細胞和LV-Mock HepG2細胞，檢測二者的細胞增殖效果的差異，觀察PHF19對HepG2細胞增殖效率的影響。
　　4.對培養(yǎng)的LV-PHF19 HepG2細胞和LV-Mock HepG2細胞進行收集，固定，染色后在流式細胞儀上進行檢測，觀

4、察PHF19對細胞周期和凋亡的調(diào)控作用。
　　三、觀察內(nèi)源性miRNA miR-195-5p對PHF19的調(diào)控作用
　　1.通過生物信息學網(wǎng)站(TargetScan，miRanda，RNA22，miRDB，miR-Gen，PITA，EMBL-EBI，starBase，PicTar，RNAhybrid and miRBase)分析與PHF19特定序列靶向結(jié)合的miRNAs，并通過熒光素酶報告試驗驗證結(jié)合位點。
　　2.在

5、HepG2細胞中轉(zhuǎn)染miR-195-5p mimic，通過蛋白印跡實驗(Western blot)檢測PHF19蛋白水平表達情況。
　　3.通過收集30例臨床HCC病人癌組織和配對癌旁組織標本，利用RT-RCR檢測組織中miR-195-5p表達情況。
　　四、觀察miR-195-5p對肝癌細胞系的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響
　　1.通過構(gòu)建miR-195-5p慢病毒過表達載體，并將載體轉(zhuǎn)染到肝癌細胞系HepG2細胞中

6、。用Transwell小室觀察過表達miR-195-5p HepG2的處理組細胞與對照組細胞的侵襲及遷移作用的差異。觀察miR-195-5p對HepG2細胞侵襲性的影響。
　　2.利用CCK-8試劑處理鋪板于96孔板的LV-miR-195-5p HepG2細胞和LV-Mock HepG2細胞，檢測二者的細胞增殖率的差異，觀察miR-195-5p對HepG2細胞增殖效率的影響。
　　五、觀察PHF19和miR-195-5p對裸

7、鼠成瘤作用的影響
　　1.分別將處理組LV-PHF19 HepG2細胞、LV-miR-195-5p細胞HepG2，對照組LV-Mock HepG2細胞配置成細胞懸液，注射到裸鼠體內(nèi)，喂養(yǎng)并每3天稱重，2周后解剖腫瘤組織進行稱重，觀察PHF19及miR-195-5p的對成瘤效果的影響。
　　結(jié)果：
　　一、觀察HCC癌組織中PHF19的表達情況
　　1.收集南方醫(yī)院臨床30例肝癌癌癥組織和配對癌旁組織標本，選取癌旁

8、組織為對照組，癌組織為處理組。提取組織RNA，通過RT-PCR分別檢測組織中PHF19的mRNA表達水平。結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，PHF19在癌組織表達顯著上調(diào)(t=-3.909，P=0.001)，有統(tǒng)計學意義。
　　一、觀察PHF19對肝癌細胞系的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響
　　1.本研究通過構(gòu)建過表達PHF19的慢病毒包裝質(zhì)粒載體，并將載體轉(zhuǎn)染到肝癌細胞系HepG2細胞，同時設立實驗組LV-PHF19 HepG2細胞

9、及對照組LV-Mock HepG2細胞，提取轉(zhuǎn)染PHF19的肝癌細胞株中的總蛋白，并利用蛋白免疫印跡技術(shù)(Western blot)對提取的細胞蛋白質(zhì)進行轉(zhuǎn)染效果驗證，結(jié)果顯不:PHF19過表達的肝癌細胞組轉(zhuǎn)染效果顯著高于對照組，組間對比有顯著性差異(F=50.43，P＜0.001)，有統(tǒng)計學意義。
　　2.利用經(jīng)典的Transwell小室實驗，觀察穩(wěn)定過表達PHF19的肝癌細胞株侵襲性是否受到增強。結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，穩(wěn)

10、定過表達PHF19后肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力都顯著增強，組間比較具有統(tǒng)計學意義(invasion:t=-8.736,P＜0.001; migration: t=-20.476，P＜0.001)。
　　3.通過CCK-8增殖實驗，我們發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，過表達PHF19可提高肝癌細胞的增殖能力，24小時(F=13.958，P=0.001)和48小時(F=20.582，P＜0.001)細胞增殖能力都顯著增高，有統(tǒng)計學意義。

11、　　4.通過流式細胞術(shù)檢測PHF19過表達后對肝癌細胞周期和凋亡的影響。結(jié)果顯示，與LV-Mock HepG2細胞相比，LV-PHF19 HepG2細胞處于G1期細胞數(shù)目減少(F=263.311，P＜0.001)，有統(tǒng)計學意義;處于S期細胞數(shù)目增多(F=249.19，P＜0.001)，有統(tǒng)計學意義;而G2M期無顯著性差異(F=0.175,P=0.679)，沒有統(tǒng)計學意義。同時凋亡檢測結(jié)果顯示:與LV-MockHepG2細胞相比，LV-P

12、HF19 HepG2細胞的細胞凋亡比率明顯減少(t=-11.724，P＜0.001)，有統(tǒng)計學意義。表明PHF19在HCC病理過程中具有重要作用。
　　三、觀察調(diào)控肝癌過程中PHF19的內(nèi)源性miRNA
　　1.為進一步研究與PHF19結(jié)合的miRNA，我們通過生物信息學網(wǎng)站(TargetScan，miRanda，RNA22，miRDB，miR-Gen，PITA，EMBL-EBI，starBase,PicTar，RNAhyb

13、rid and miRBase)分析與PHF19靶向結(jié)合的miRNAs，并通過熒光素酶報告實驗驗證結(jié)合位點，結(jié)果顯示PHF19的3'UTR與miR-195-5p區(qū)存在互補配對序列。
　　2.在HepG2細胞中轉(zhuǎn)染has-miR-195-5p mimic，通過蛋白印跡實驗(Westernblot)檢測PHF19蛋白水平表達情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，has-miR-195-5p可明顯下調(diào)PHF19的蛋白水平表達，兩組有統(tǒng)計學差異(

14、F=32.033，P＜0.001)。
　　3.對所收集臨床30例HCC病人癌組織和配對癌旁組織標本，提取其RNA，利用RT-RCR檢測miR-195-5p基因水平表達情況，結(jié)果顯示癌組織中miR-195-5p表達顯著低于對照組(t=6.67，P=0.001)，有統(tǒng)計學意義。驗證了miR-195-5p與PHF19表達呈相反變化趨勢。
　　四、觀察miR-195-5p對肝癌細胞的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響
　　1.構(gòu)建m

15、iR-195-5p慢病毒過表達載體，并將載體轉(zhuǎn)染到肝癌細胞HepG2中。通過Transwell實驗，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，過表達miR-195-5p可顯著抑制肝癌細胞的體外侵襲(t=11.490，P＜0.001)和轉(zhuǎn)移能力(t=11.355，P＜0.001)，有統(tǒng)計學意義。
　　2.增殖實驗結(jié)果顯示，相對于對照組，過表達miR-195-5p后24小時HepG2細胞的增殖活力(F=13.489，P=0.001)和48小時(F=16.98

16、8，P=0.000)細胞增殖能力均有顯著下降，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　五、觀察PHF19和miR-195-5p對裸鼠成瘤作用的影響
　　1.與體外細胞實驗結(jié)果相一致，體內(nèi)動物實驗結(jié)果表明，注射表達慢病毒空載載體肝癌細胞的對照組中裸鼠體內(nèi)瘤塊并未明顯變化，而注射PHF19過表達的肝癌細胞成瘤作用顯著高于對照組(t=6.14，P＜0.001)，注射miR-195-5p過表達組肝癌細胞則成瘤作用顯著低于對照組(t=-4

17、.552，P＜0.001)，均有統(tǒng)計學意義。以上結(jié)果表明:PHF19具有成瘤作用，而miR-195-5p具有抑瘤作用。
　　結(jié)論：
　　1.PHF19在肝癌組織中表達明顯高于配對癌旁組織，與肝癌發(fā)展相關(guān)。
　　2.過表達PHF19可明顯促進肝癌細胞的增殖、遷移和生長，并抑制細胞凋亡;3.miR-195-5p通過靶向調(diào)控PHF19的轉(zhuǎn)錄，并下調(diào)PHF19的表達;
　　4.miR-195-5p在肝癌組織中表達明顯低于