Eos蛋白在紅系和巨核系分化中的功能研究.pdf

1、背景：
　　造血分化是生物體內(nèi)重要的生理過(guò)程，不僅涉及造血干細(xì)胞(Hematopoietic stemcells，HSC)的自我更新、各鏈系祖細(xì)胞的定向分化，還包括祖細(xì)胞向成熟血細(xì)胞分化和發(fā)育的全過(guò)程。紅系分化和巨核系分化是造血分化的重要分支，也是貫穿人一生的重要生理過(guò)程。轉(zhuǎn)錄因子Eos也叫IKZF4(ikaros familyzinc finger4)，是鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子ikaros家族中的一員。作為負(fù)性調(diào)節(jié)因子可以參與許多基因

2、的表達(dá)調(diào)控。有研究表明，Eos也參與了造血過(guò)程中紅系的分化，但作用機(jī)制還不清楚。而關(guān)于Eos在巨核系分化中的作用及其機(jī)制知之更少。
　　目的：
　　分析轉(zhuǎn)錄因子Eos在紅系和巨核系分化中的作用，并初步探討其調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的K562細(xì)胞分為紅系誘導(dǎo)組和巨核系誘導(dǎo)組進(jìn)行傳代培養(yǎng)。前者傳至4個(gè)中號(hào)培養(yǎng)皿中，分別標(biāo)記為0h、12h、24h、48h4個(gè)時(shí)間段，加入50μM氯化高鐵血

3、紅素(Hemin)。后者傳至6個(gè)中號(hào)培養(yǎng)皿中，分別標(biāo)記為0h、12h、24h、48h、72h、96h，6個(gè)時(shí)間段，加入50pM佛波酯(PMA)。在37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)K562細(xì)胞分別向紅系和巨核系分化。
　　2.聯(lián)苯胺染色與瑞氏-姬姆薩染色:收集各組細(xì)胞，1000 rpm離心5min，收集沉淀，用胎牛血清重懸，涂片染色，鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。
　　3.流式細(xì)胞檢測(cè):收集各培養(yǎng)組細(xì)胞，檢測(cè)誘導(dǎo)前后細(xì)胞分化相

4、關(guān)表面標(biāo)志物CD41a、CD61、CD235a、CD71的表達(dá)情況。
　　4.Real-time PCR檢測(cè):收集細(xì)胞，提取RNA，檢測(cè)誘導(dǎo)后Eos mRNA的表達(dá)量。
　　5.Western blot蛋白檢測(cè):收集各培養(yǎng)組細(xì)胞，裂解后提取蛋白，Western blot檢測(cè)誘導(dǎo)前后轉(zhuǎn)錄因子Eos和紅系特異轉(zhuǎn)錄因子GATA-1蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.K562細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)后瑞氏-姬姆薩染色，隨著誘導(dǎo)

5、時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞體積變大，核越來(lái)越大，大核細(xì)胞增多，這些結(jié)果進(jìn)一步顯示PMA誘導(dǎo)K562細(xì)胞巨核系分化成功。
　　2.K562細(xì)胞經(jīng)Hemin誘導(dǎo)后，隨紅系分化過(guò)程Eos蛋白和mRNA表達(dá)水平逐漸下降。
　　3.K562細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Eos，然后經(jīng)Hemin誘導(dǎo)48h后，流式結(jié)果顯示紅系細(xì)胞表面標(biāo)志CD71、CD235a的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明Eos對(duì)K562細(xì)胞紅系分化有抑制作用。
　　4.過(guò)表

6、達(dá)Eos的K562細(xì)胞經(jīng)Hemin誘導(dǎo)48h后，聯(lián)苯胺染色顯示細(xì)胞紅系分化的陽(yáng)性率明顯低于對(duì)照組，進(jìn)一步說(shuō)明Eos蛋白對(duì)紅系分化有抑制作用。
　　5.K562細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)后Eos蛋白表達(dá)水平逐漸下降，GATA-1蛋白水平逐漸升高。
　　6.K562細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)后，巨核系細(xì)胞表面標(biāo)志CD41a、CD61表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而升高，說(shuō)明PMA對(duì)K562細(xì)胞的巨核系分化誘導(dǎo)成功。
　　結(jié)論：
　　Eos蛋白在H