Wnt-10a在紅系分化中的功能研究.pdf

1、紅系分化是生物體內(nèi)復(fù)雜又精細(xì)的重要調(diào)控過(guò)程之一，涉及機(jī)體的發(fā)育，干細(xì)胞分化與體細(xì)胞起源，細(xì)胞癌變的調(diào)控失序等。紅系分化的過(guò)程由眾多的轉(zhuǎn)錄因子，小分子物質(zhì)如piRNA和microRNA，各種信號(hào)通路的綜合調(diào)控協(xié)同進(jìn)行。當(dāng)其中的某種調(diào)控方式出現(xiàn)異常，則可能會(huì)使得造血干細(xì)胞的正常分化機(jī)制失調(diào)，細(xì)胞過(guò)度增殖導(dǎo)致疾病甚至癌癥的發(fā)生。一系列關(guān)于白血病的相關(guān)研究中已發(fā)現(xiàn)，在某些小分子物質(zhì)如亞鐵血紅素、二甲基亞砜、丁酸鈉等的誘導(dǎo)下白血病細(xì)胞能夠發(fā)生逆轉(zhuǎn)

2、，表明細(xì)胞的分化狀態(tài)可以被人為地調(diào)控。至今為止，主要是通過(guò)發(fā)現(xiàn)和研究與分化相關(guān)的蛋白質(zhì)（如細(xì)胞分化因子）的功能來(lái)解析紅系分化調(diào)控機(jī)制。蛋白質(zhì)組學(xué)的思路與技術(shù)以及基因芯片等技術(shù)為此研究提供了關(guān)鍵的支撐作用，也為研發(fā)能使白血病細(xì)胞自癌變狀態(tài)脫離，進(jìn)入可控正常分化凋亡途徑并且適用于臨床的的誘導(dǎo)劑提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　各種白血病細(xì)胞如MEL細(xì)胞與K562是研究細(xì)胞分化的重要模型細(xì)胞系，在某些誘導(dǎo)劑存在的體外培養(yǎng)條件下，這些細(xì)胞能夠進(jìn)入紅系

3、分化途徑，重新表達(dá)分化后特有的紅系標(biāo)志蛋白如血紅蛋白和血型糖蛋白A等。本文前期利用雙向凝膠電泳/質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，通過(guò)比較亞鐵血紅素(Hemin)誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞K562分化前后的差異蛋白質(zhì)組，得到了數(shù)百種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。
　　Wnt是一大類(lèi)與胚胎發(fā)育，干細(xì)胞維持與分化，細(xì)胞增殖、遷移、極性決定、死亡及癌癥發(fā)生有關(guān)的分泌型糖蛋白家族。由于Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也參與了干細(xì)胞的分化調(diào)控，而Wnt-10a又是在K562細(xì)胞誘導(dǎo)前后呈現(xiàn)

4、明顯差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。為了進(jìn)一步研究Wnt-10a在紅系分化中的功能及其與紅系分化的關(guān)系，本文通過(guò)Western Blot，半定量PCR，Real-Time PCR對(duì)Wnt-10a在K562細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中表達(dá)量的變化進(jìn)行分析，又通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)研究了Wnt-10a蛋白在細(xì)胞中的定位情況，同時(shí)利用MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)誘導(dǎo)分化的K562細(xì)胞活性變化進(jìn)行了檢測(cè)。此外，通過(guò)構(gòu)建Wnt-10a重組過(guò)表達(dá)載體來(lái)提高K562細(xì)胞中Wnt-10a的表達(dá)量后

5、進(jìn)行細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力和Wnt信號(hào)途徑中關(guān)鍵因子蛋白水平的檢測(cè)，加入Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活劑來(lái)進(jìn)一步研究Wnt信號(hào)途徑對(duì)紅白血病細(xì)胞誘導(dǎo)分化所產(chǎn)生的影響。
　　結(jié)果表明:在Hemin誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化過(guò)程中，Western Blot和半定量PCR分析均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中的Wnt-10a蛋白表達(dá)量和mRNA量都出現(xiàn)了短暫下降后回復(fù)的趨勢(shì)，于此同時(shí)，也在K562誘導(dǎo)分化的過(guò)程中Wnt-10a向胞膜遷移。而Western Blot、半定量PC

6、R與Real-Time PCR都證實(shí)了在Hemin誘導(dǎo)K562細(xì)胞紅系分化的過(guò)程中，Wnt蛋白所參與的三條信號(hào)途徑中的關(guān)鍵因子表達(dá)水平均有著不同程度的變化，說(shuō)明Wnt信號(hào)通路在紅系分化中起著重要的作用。使用Wnt信號(hào)通路抑制劑后，誘導(dǎo)分化過(guò)程中的細(xì)胞增殖活力提高情況，Wnt-10a過(guò)表達(dá)后，K562被Hemin誘導(dǎo)分化的能力也有了提高，并且Wnt經(jīng)典信號(hào)途徑的關(guān)鍵因子表達(dá)水平也有上升，上述兩點(diǎn)同樣從另一個(gè)側(cè)面證實(shí)Wnt信號(hào)通路對(duì)于白血病