基于Aptamer-二氧化硅熒光納米探針的金黃色葡萄球菌檢測(cè)研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌是一種革蘭氏陽性菌，是人類化膿感染中最常見的病原菌。美國(guó)疾病控制中心報(bào)告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。近年來，很多快速、靈敏檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法在生物醫(yī)學(xué)分析領(lǐng)域中發(fā)揮了重要作用，尤其是一些利用抗體-抗原識(shí)別原理發(fā)展的生物傳感方法，如原子力顯微鏡法、酶聯(lián)免疫吸附法、表面等離子體共振法及熒光免疫測(cè)定法等。然而基于抗體-抗原識(shí)別原理發(fā)展的金黃色葡萄球菌生物傳感方法由于抗體的難合成、不易修飾、生物活性

2、不穩(wěn)定且成本高等而導(dǎo)致其存在一定的局限性。核酸適配體(Aptamer)作為一種新型特異性識(shí)別分子具有高穩(wěn)定性、高選擇性，且穩(wěn)定性好、合成簡(jiǎn)便、容易標(biāo)記、適用性廣等優(yōu)點(diǎn)，為發(fā)展快速、靈敏的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法提供了新的思路。然而目前報(bào)道的基于Aptamer特異性識(shí)別的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法主要是電化學(xué)傳感法和熒光光譜測(cè)定法，這些方法操作復(fù)雜，且不能實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。雙色流式細(xì)胞術(shù)能對(duì)細(xì)胞或者其他生物粒子進(jìn)行定性、定量分析。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法

3、相比，具有免洗和速度快等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)代先進(jìn)的細(xì)胞、生物粒子定量分析技術(shù)之一。同時(shí)，融合介電電泳原理和微流控芯片技術(shù)發(fā)展介電泳驅(qū)動(dòng)在線富集技術(shù)能對(duì)細(xì)胞、細(xì)菌等復(fù)雜生化樣品進(jìn)行高效迅速富集和分離，為建立快速、靈敏的細(xì)菌體系檢測(cè)提供了技術(shù)平臺(tái)。本論文即以實(shí)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的快速、靈敏檢測(cè)為研究目標(biāo)，采用Aptamer作為特異性識(shí)別分子，結(jié)合本課題組已發(fā)展的基于熒光納米顆粒標(biāo)記信號(hào)放大技術(shù)的雙色流式細(xì)胞術(shù)和基于熒光納米顆粒標(biāo)記信號(hào)放大技術(shù)的微流

4、控芯片介電電泳富集技術(shù)，開展了基于Aptamer/二氧化硅熒光納米探針的金黃色葡萄球菌檢測(cè)研究，主要工作如下:
　　一、基于Aptamer/二氧化硅熒光納米探針的雙色流式細(xì)胞術(shù)用于金黃色葡萄球菌檢測(cè)研究
　　以Aptamer作為特異性分子識(shí)別探針，結(jié)合課題組的熒光納米顆粒標(biāo)記雙色流式細(xì)胞術(shù)發(fā)展了一種快速、靈敏的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法。在該方法中，首先采用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將特異性識(shí)別金黃色葡萄球菌的Aptamer修飾在二氧化硅熒光

5、納米顆粒表面，獲得Aptamer/二氧化硅熒光納米探針復(fù)合物，然后考察該復(fù)合物探針對(duì)金黃色葡萄球菌的特異性識(shí)別，并通過激光共聚焦顯微鏡成像實(shí)驗(yàn)證實(shí)識(shí)別效果。在此基礎(chǔ)上，將Aptamer/二氧化硅熒光納米探針與金黃色葡萄球菌樣品進(jìn)行孵育，然后以核酸染料SYBRGreenⅠ對(duì)熒光標(biāo)記的金黃色葡萄球菌進(jìn)行核酸染色，通過雙參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)樣品中雙色標(biāo)記的金黃色葡萄球菌進(jìn)行分析檢測(cè)。結(jié)果表明，該Aptamer/二氧化硅熒光納米探針具有非常高的選擇

6、性和靈敏度，以核酸染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色，顯著地減小了由納米顆粒團(tuán)聚所引起的假陽性信號(hào)，對(duì)緩沖液體系和牛奶樣品中摻雜金黃色葡萄球菌的檢測(cè)下限分別為1.5×102和7.6×102cellsmL-1。與基于抗體-抗原免疫反應(yīng)的傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)相比，該方法具有更高的檢測(cè)靈敏度。
　　二、基于Aptamer/二氧化硅熒光納米探針的微流控芯片介電電泳富集技術(shù)用于金黃色葡萄球菌檢測(cè)研究
　　以Aptamer作為特異性分子識(shí)別探針，結(jié)合課題組的

7、熒光納米顆粒標(biāo)記信號(hào)放大的微流控芯片介電電泳富集技術(shù)發(fā)展了一種金黃色葡萄球菌的實(shí)時(shí)、連續(xù)、快速和高靈敏檢測(cè)新方法。在該方法中，先將Aptamer/二氧化硅熒光納米探針復(fù)合物與金黃色葡萄球菌進(jìn)行孵育，通過Aptamer對(duì)目標(biāo)金黃色葡萄球菌的特異性識(shí)別，從而將Aptamer/二氧化硅熒光納米探針復(fù)合物標(biāo)記到金黃色葡萄球菌上進(jìn)行熒光信號(hào)放大，然后將該樣品通入到微流控芯片中，并采用介電電泳驅(qū)動(dòng)技術(shù)對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行實(shí)時(shí)、定向富集;最后通過監(jiān)測(cè)