攜帶人NIS基因和TPO基因的重組腺病毒聯(lián)合轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞介導(dǎo)放射性碘攝取和有機(jī)化的基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：NIS基因轉(zhuǎn)染非甲狀腺腫瘤介導(dǎo)放射性核素內(nèi)放射治療成為腫瘤基因治療的又一研究方向。盡管轉(zhuǎn)染了NIS基因的腫瘤細(xì)胞或病灶，均能迅速大量攝取放射性碘，但碘在細(xì)胞或病灶內(nèi)停留時(shí)間短，療效不理想。我們利用腺病毒載體將NIS和TPO基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，試圖延長(zhǎng)放射性碘在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的儲(chǔ)留時(shí)間，達(dá)到提高療效的目的。 方法：1.用RT-PCR方法從Graves'甲亢病人甲狀腺組織中擴(kuò)增出hNIS和hTPO基因，亞克隆到質(zhì)粒載體，構(gòu)建成p

2、GEM-Teasy-NIS重組質(zhì)粒和PBK-CMV-TPO重組質(zhì)粒，通過(guò)酶切和DNA序列分析進(jìn)行鑒定。 2.將hNIS和hTPO基因分別克隆到腺病毒AdEasier系統(tǒng)的穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV上，通過(guò)在大腸桿菌BJ5183內(nèi)同骨架質(zhì)粒pAdEasy-1同源重組、并在293細(xì)胞中包裝、擴(kuò)增，純化、構(gòu)建攜帶hNIS和hTPO的重組腺病毒AdNIS和AdTPO,測(cè)定病毒滴度。Western-Blotting檢測(cè)重組腺病毒AdN

3、IS和AdTPO的表達(dá)。 3.AdNIS單獨(dú)轉(zhuǎn)染，AdNIS和AdTPO聯(lián)合轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2，確定最適MOI，動(dòng)態(tài)檢測(cè)125I的攝取、觀測(cè)NaClO4對(duì)碘攝取抑制情況、TCA蛋白沉淀檢測(cè)碘化蛋白、動(dòng)態(tài)檢測(cè)碘排泄情況，細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)單獨(dú)和聯(lián)合轉(zhuǎn)染131I細(xì)胞毒性作用。 4.荷瘤裸鼠瘤體內(nèi)引入AdNIS，免疫組化檢測(cè)腫瘤NIS表達(dá)，測(cè)定注射125I后各時(shí)間點(diǎn)組織器官放射性，計(jì)算每克組織百分注射劑量率(％ID/g)

4、，進(jìn)行131I荷瘤裸鼠腫瘤顯像研究。 結(jié)果：1.酶切、DNA序列分析鑒定hNIS和hTPO基因克隆成功。 2.構(gòu)建重組腺病毒AdNIS和AdTPO，測(cè)定滴度分別為1.5×109efu/ml、2.0×109efu/ml。AdNIS和AdTPO轉(zhuǎn)染人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞，經(jīng)SDS-PAGE電泳，分別探測(cè)到90kD和110kD的特異性的蛋白，免疫雜交能與小鼠抗人NIS或TPO單克隆抗體結(jié)合。 3.轉(zhuǎn)染AdNIS的He

5、pG2細(xì)胞能迅速攝取125I，其攝取能力為未轉(zhuǎn)染組的24倍，攝碘功能可被NaClO4特異性抑制，16min時(shí)一半的125I已流出細(xì)胞外。聯(lián)合轉(zhuǎn)染AdNIS和AdTPO不能提高細(xì)胞對(duì)碘的攝取(p＞0.05)，但可部分有機(jī)化碘，125I流出細(xì)胞延緩，Tl/2efflux約為25min。AdNIS單獨(dú)轉(zhuǎn)染可使40％細(xì)胞、聯(lián)合轉(zhuǎn)染可使60％細(xì)胞被131I選擇性殺死。 4.免疫染色檢測(cè)到NIS在腫瘤組織中的表達(dá)，且定位于細(xì)胞膜；2h時(shí)腫瘤

6、組織攝取125I最高，為10.10±1.81％ID/g，125I在腫瘤組織內(nèi)的生物半衰期為2.35h。轉(zhuǎn)染NIS的肝癌荷瘤裸鼠注射131I后2h，腫瘤部位放射性濃聚，腫瘤顯示清晰。 結(jié)論：成功克隆hNIS和hTPO基因，利用腺病毒AdEasier系統(tǒng)，快速、簡(jiǎn)便獲取高滴度的重組腺病毒AdNIS和AdTPO。AdNIS轉(zhuǎn)染可使肝癌細(xì)胞獲得攝碘功能，聯(lián)合轉(zhuǎn)染AdNIS和AdTPO，可部分有機(jī)化碘，但只能輕度延長(zhǎng)125I在細(xì)胞內(nèi)的停留