大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞移植對小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎治療作用的初步探究.pdf

1、目的：
　　體外分離培養(yǎng)鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（Rat bone marrow mesenchymal stem cells,Rat BM-MSCs）并初步探究其對小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）的治療作用。
　　方法:
　　1.取SPF級大鼠骨髓，貼壁培養(yǎng)法獲得BM-MSCs，觀察細胞形態(tài)、對P3代細胞進行細胞表面抗原標(biāo)志物C

2、D29、CD90、CD106、CD45鑒定以及BM-MSCs成骨、成脂分化鑒定。2.取20只雌性C57BL/6小鼠，隨機分為三組：正常對照組（Control組）、PBS組和Rat BM-MSCs組。Rat BM-MSCs細胞移植后小鼠作為Rat BM-MSCs組，PBS移植后小鼠作為PBS組，未作處理小鼠作為正常對照組。MOG35-55聯(lián)合完全弗氏佐劑充分乳化后，背部皮下多點注射免疫，誘發(fā)小鼠EAE。3.小鼠免疫后第38d腹腔注射Rat

3、 BM-MSCs（1×106cells/200μl）進行治療，PBS組注射等體積PBS，10d后再次治療，每天進行神經(jīng)功能評分觀察各組小鼠神經(jīng)功能變化。4.二次移植治療12d后取各組小鼠脊髓：HE染色及Luxol Fast Blue染色觀察脊髓炎性細胞浸潤以及髓鞘脫失情況；5.Rat BM-MSCs細胞二次移植后第12d獲取各組小鼠脾臟制成單細胞懸液，脾細胞CFSE標(biāo)記后10μg/ml ConA和MOG35-55刺激培養(yǎng)3d，收細胞，流

4、式細胞術(shù)檢測脾細胞增殖情況；6. Rat BM-MSCs細胞二次移植后第12d收集小鼠外周血血清，Ellisa技術(shù)檢測正常對照組、PBS組和Rat BM-MSCs組外周血中細胞因子：干擾素γ（IFN-γ），白介素17(IL-17)的含量。
　　結(jié)果：
　　1. Rat BM-MSCs成功分離培養(yǎng)，P3代細胞呈梭形或多角形，呈典型旋渦狀生長；流式細胞術(shù)顯示Rat BM-MSC P3代細胞表達抗原CD29、CD90、CD106，

5、不表達CD45；BM-MSCs體外誘導(dǎo)能向成骨及成脂方向分化。2. C57BL/6小鼠發(fā)病后，EAE小鼠神經(jīng)功能癥狀加重，臨床評分逐漸升高，BM-MSCs移植后，Rat BM-MSCs組小鼠神經(jīng)功能缺損癥狀較PBS組減輕，評分降低，二次移植后臨床癥狀維持進一步好轉(zhuǎn)。3.HE染色結(jié)果顯示，Rat BM-MSCs組脊髓炎性細胞浸潤比同時間點PBS組減輕(P＜0.05)；Luxol Fast Blue染色結(jié)果顯示，Rat BM-MSCs組脫髓

6、鞘比同時間點PBS組減輕(P＜0.05)；病理結(jié)果分析，BM-MSCs移植后小鼠脊髓炎癥浸潤和脫髓鞘情況得以改善。4.流式細胞術(shù)分析，ConA和MOG35-55刺激培養(yǎng)3d后， PBS組和Rat BM-MSCs組脾細胞增殖明顯增加，而Rat BM-MSCs組又較PBS組降低。5.ELISA結(jié)果分析，與正常對照組相比，PBS組小鼠外周血血漿中促炎細胞因子IFN-γ、IL-17含量升高；與PBS組相比，Rat BM-MSCs組小鼠