間充質(zhì)干細胞治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎的療效和免疫調(diào)節(jié)機制.pdf

1、背景與目的：
　　間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells, MSC）是一類具有塑料貼壁性,呈纖維狀,具有自我復(fù)制，自我更新和多向分化潛能的非造血基質(zhì)細胞，存在于機體的骨髓和大量的結(jié)締組織中，是干細胞家族的重要成員。在體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪，軟骨，骨，肌肉，肌腱，神經(jīng)，肝，心肌，胰島β細胞和內(nèi)皮等多種組織細胞，甚至其多向分化潛能在連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍舊存在。MSC細胞的表面標記具有明顯特征：高表

2、達CD90，CD105，CD44， CD73，CD4等分子，不表達造血細胞表面標記CD34，CD45，CD11b，CD11c， CD14，CD19，CD86和MHC-Ⅱ類分子。因此，我們可根據(jù)MSC細胞的這些特性來有效的判斷其在體外培養(yǎng)之后的純度,以此來指導(dǎo)我們對 MSC細胞的研究。另外，不論是自體還是同種異體的MSC細胞均不會引起宿主細胞的免疫反應(yīng)，即間充質(zhì)干細胞的低免疫原性，這一特性使其應(yīng)用于細胞治療方面的研究成為可能。近年來，MS

3、C細胞抑制同種異體T淋巴細胞活化和增殖的免疫調(diào)節(jié)作用也被不斷證實：有學(xué)者認為MSC細胞可釋放可溶性細胞因子而發(fā)揮免疫抑制作用；也有研究發(fā)現(xiàn)MSC細胞可通過與靶細胞之間細胞細胞直接接觸達到免疫調(diào)節(jié)功能；更有學(xué)者稱MSC細胞的免疫調(diào)節(jié)作用伴隨著細胞凋亡和細胞周期的變化。隨MSC細胞應(yīng)用于治療自身免疫性疾病或者腫瘤等疾病的研究狂熱，更多的人開始關(guān)注其臨床效果和持續(xù)時間。因此本研究的主要目的是觀察具有綠色熒光標記GFP的MSC細胞移植至多發(fā)性硬

4、化癥C57BL/6小鼠模型-實驗性自身免疫性腦脊髓炎后的療效，并探討其在細胞因子和細胞水平的免疫調(diào)節(jié)機制，并追蹤有GFP熒光標記的供體MSC細胞在受體C57BL/6小鼠體內(nèi)的作用部位，數(shù)量變化和作用時間,來了解MSC細胞的療效持久性。
　　材料和方法：
　　1．選用20-25g，6-8周齡的雄性C57BL/6小鼠和GFP-C57BL/6小鼠「北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001」作

5、為實驗對象。30只 C57BL/6小鼠進行 EAE誘導(dǎo)做為受體小鼠，20只GFP-C57BL/6小鼠作為GFP-MSC細胞的供體小鼠。GFP-MSC細胞移植后小鼠作為MSC治療組，PBS移植后作為EAE組,未做處理的小鼠作為正常組。
　　2．誘導(dǎo)EAE模型：5mg/ml的CFA與1.5mg/ml的MOG35-55溶液按等體積1:1混合，使用注射器反復(fù)推拉成油包水的乳劑，皮下免疫C57BL/6小鼠200ul/只；在MOG免疫第0天和

6、第2天尾靜脈注射百日咳毒素（pertussis toxin, PT）2ul/只（稀釋于200ul PBS溶液中）。
　　3．獲取GFP-MSC細胞：頸椎脫臼處死 GFP-C57BL/6小鼠，在無菌條件下剝離其脛骨和股骨，暴露骨髓腔，使用無菌的含有15％ FBS的DMEM培養(yǎng)液沖洗出骨髓細胞，放置在37℃35%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；培養(yǎng)4h后給細胞換液去除未貼壁細胞，之后的換液頻次修改為每12h一次，可根據(jù)細胞的鋪滿率約3天傳代一

7、次(使用胰蛋白酶消化貼壁細胞，換液后重新培養(yǎng))；采用光學(xué)顯微鏡技術(shù)和流式分析術(shù)來鑒定其純度。
　　4．獲取移植后15天EAE組和MSC治療組小鼠的脊髓組織切片并HE染色：20g/L戊巴比妥鈉100ul麻醉小鼠，40g/L多聚甲醛進行心臟灌注，取出其脊髓組織；多聚甲醛固定24h后，送至鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科進行組織切片，并HE染色。
　　5．采用ELISA技術(shù)檢測EAE組，MSC治療組和正常組小鼠外周血血漿中細胞因子：腫瘤

8、壞死因子α（TNF-α），干擾素γ（IFN-γ），白介素4(IL-4)，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)的含量，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　6．采用流式細胞術(shù)檢測細胞移植后第2天和第10天受體小鼠脾臟細胞中調(diào)節(jié)性T細胞(CD4+Foxp3+)的比例；同時檢測這兩個時間點間充質(zhì)干細胞移植后小鼠脊髓組織單個核細胞中GFP+細胞的比例。
　　結(jié)果：
　　1．間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)純化成功：MSC傳代培養(yǎng)至第5代，光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)呈梭

9、形，紡錘形或者多角形等；流式分析結(jié)果顯示，95%以上的第5代MSC細胞表面抗原為CD34-CD45-CD105+。
　　2．間充質(zhì)干細胞移植后對EAE小鼠療效顯著：與EAE組小鼠相比，MSC治療組小鼠在MSC細胞移植后第2天臨床評分就明顯降低（p＜0.05），之后仍舊以緩慢的速度改善小鼠的臨床癥狀；脊髓組織病理分析結(jié)果顯示，在MSC細胞移植后15天小鼠的有核細胞浸潤情況明顯改善。
　　3．與正常組小鼠相比，EAE組小鼠外周血

10、血漿中促炎因子 TNF-α（21.94±0.46pg/ml）和IFN-γ（203.8±0.19pg/ml）的含量顯著升高（p＜0.05），抗炎因子IL-4（12.87±0.14pg/ml）和TGF-β（6.74±0.06pg/ml）的含量顯著降低（p＜0.05）；與 EAE組小鼠相比，MSC治療組小鼠外周血血漿中促炎因子TNF-α（13.82±0.24pg/ml）和IFN-γ（100.0±0.31pg/ml）的含量顯著降低（p＜0.05

11、），抗炎因子IL-4（27.30±0.22pg/ml）和TGF-β（12.09±0.09pg/ml）的含量顯著升高（ p＜0.05）；甚至， MSC治療組小鼠 IFN-γ的含量低于正常組（141.5±0.21pg/ml）（p＜0.05）。
　　4．流式細胞術(shù)分析受體小鼠脾臟細胞中調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）的比例變化：MSC治療組小鼠脾臟細胞中Treg細胞的比例（19.08±0.33）%顯著高于EAE組（6.32±0.19）%和正常組

12、（11.20±0.37）%（p＜0.01）。
　　5．流式細胞術(shù)分析 MSC細胞移植后第2天和第10天受體小鼠脊髓中GFP+MSC細胞的比例：MSC移植后第2天 GFP+MSC細胞的比例為（1.82±0.08）%，第10天GFP+MSC細胞基本消失。
　　結(jié)論：
　　1, MSC對EAE小鼠療效顯著；
　　2，MSC對EAE的治療緩解作用與其調(diào)節(jié)細胞因子的分泌和上調(diào)Treg細胞有關(guān)；
　　3，MSC對EAE