S100A13基因在甲狀腺癌中的表達(dá)及相關(guān)作用研究.pdf

1、甲狀腺癌(thyroid carcinoma)是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病機(jī)制尚未明確。S100蛋白家族是一個(gè)已發(fā)現(xiàn)有21個(gè)成員的鈣結(jié)合蛋白家族,S100蛋白通過對(duì)鈣離子的調(diào)節(jié)及與靶蛋白的相互作用在體內(nèi)發(fā)揮多種生物學(xué)功能。S100A13屬于鈣結(jié)合蛋白家族的一個(gè)新成員,S100A13既具有S100蛋白家族的一些共性,又有其獨(dú)有的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)。FGF-1是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族重要的成員之一,一些高侵襲性的腫瘤與FGF-1的高表

2、達(dá)有關(guān)。研究表明S100A13通過介導(dǎo)FGF-1、IL-1α跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),在腫瘤、炎癥、動(dòng)脈硬化等疾病的病理過程中發(fā)揮著重要作用。
　　本研究在前期運(yùn)用抑制性消減雜交技術(shù)( suppression subtractive hybridization, SSH)篩選正常甲狀腺組織和甲狀腺癌組織內(nèi)差異表達(dá)的基礎(chǔ)上,通過免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)正常甲狀腺組織和甲狀腺癌組織內(nèi)S100A13蛋白、FGF-1蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了S100A13基

3、因在甲狀腺癌中的表達(dá)高于正常甲狀腺組織。在此基礎(chǔ)上,通過構(gòu)建 S100A13基因真核表達(dá)載體、基因轉(zhuǎn)染等方法觀察S100A13基因在甲狀腺癌組織高表達(dá)后S100A13基因?qū)θ思谞钕偎铇影┘?xì)胞(TT細(xì)胞)生長(zhǎng)特性、裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)S100A13基因?qū)T細(xì)胞的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用,能促進(jìn)TT細(xì)胞從G0/G1期向S期及G2/M期過渡,S100A13高表達(dá)的TT細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)速度最快,重量最重,移植瘤中S100A13的高表

4、達(dá)能增強(qiáng)Cyclin E、FGF-1、CD31蛋白的表達(dá)。隨后觀察shRNA干擾S100A13基因表達(dá)和使用Ca2+螯合劑后對(duì)TT細(xì)胞釋放FGF-1的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)S100A13基因的沉默可以抑制FGF-1從細(xì)胞內(nèi)釋放到細(xì)胞外,Ca2+螯合劑能有效拮抗無血清處理引起的TT細(xì)胞[Ca2+]i升高和S100A13、FGF-1蛋白的釋放。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明S100A13基因高表達(dá)后促進(jìn)FGF-1表達(dá)和釋放是甲狀腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。
　　

5、第一部分，甲狀腺癌組織中S100A13和FGF-1蛋白的表達(dá)及意義
　　目的:探討S100A13、FGF-1蛋白在甲狀腺癌中的表達(dá)及臨床意義。方法:采用免疫組織化學(xué)法,檢測(cè)56例甲狀腺癌、15例甲狀腺腺瘤、14例甲狀腺正常組織中S100A13及FGF-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果:甲狀腺癌、甲狀腺腺瘤、甲狀腺正常組織中S100A13蛋白陽性表達(dá)率分別為91.1％、66.7%、64.3%,FGF-1蛋白陽性表達(dá)率分別為89.3%、60.0%、

6、57.1%,其中甲狀腺癌與甲狀腺腺瘤、甲狀腺正常組織比較均有顯著性差異(P<0.05);伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌組織S100A13、FGF-1蛋白強(qiáng)陽性表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。結(jié)論:S100A13蛋白、FGF-1蛋白在甲狀腺癌中陽性表達(dá)顯著高于甲狀腺腺瘤及正常甲狀腺組織,其強(qiáng)陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　第二部分，S100A13對(duì)甲狀腺癌TT細(xì)胞生長(zhǎng)特性的影響
　　目的:觀察S100A13基因高表達(dá)對(duì)T

7、T細(xì)胞生長(zhǎng)特性的影響。方法:構(gòu)建以綠色熒光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)為報(bào)告基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/NT-GFP-S100A13,脂質(zhì)體介導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 TT細(xì)胞,激光共聚焦顯微鏡觀察外源性S100A13蛋白在細(xì)胞中的定位,采用real-time RT-PCR和Western blot鑒定穩(wěn)定高表達(dá) S100A13基因的TT細(xì)胞系,細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)高表達(dá) S100A13基因

8、對(duì)甲狀腺癌 TT細(xì)胞生長(zhǎng)速率和細(xì)胞周期的影響。結(jié)果:酶切和測(cè)序結(jié)果證實(shí)重組質(zhì)粒含有S100A13編碼區(qū)序列且插入方向正確,成功建立了穩(wěn)定高表達(dá)S100A13基因和空載體的TT細(xì)胞系TT-S100A13-GFP、TT-GFP。TT-S100A13-GFP、TT-GFP和TT細(xì)胞培養(yǎng)7天后細(xì)胞數(shù)目分別為(2.30±0.24)×105、(1.40±0.25)×105和(1.50±0.22)×105(P<0.05);TT-S100A13-GFP

9、、TT-GFP和TT經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)S期的細(xì)胞比例分別為6.47±0.14%、5.86±0.23%和5.99±0.28%(P<0.05), G2/M期的細(xì)胞比例分別為50.27±0.66%、39.39±0.23%和39.64±0.64%(P<0.05)。
　　結(jié)論:成功建立了穩(wěn)定高表達(dá)S100A13基因的TT細(xì)胞系,高表達(dá)S100A13基因?qū)T細(xì)胞的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用,促進(jìn)TT細(xì)胞從G0/G1期向S期及G2/M期過渡。
　　

10、第三部分，S100A13對(duì)TT細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:通過建立裸鼠移植瘤模型,探討S100A13對(duì)TT細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的作用,初步闡明S100A13在甲狀腺癌發(fā)生中的作用。方法:同時(shí)分別擴(kuò)大培養(yǎng)穩(wěn)定高表達(dá)S100A13的TT細(xì)胞(TT-S100A13-GFP)和空載體(TT-GFP)TT細(xì)胞及TT細(xì)胞,將三種瘤細(xì)胞接種于裸鼠背部皮下,通過測(cè)量三組裸鼠移植瘤體積、瘤重,評(píng)價(jià)S100A13基因轉(zhuǎn)染對(duì)TT細(xì)胞裸鼠移

11、植瘤生長(zhǎng)的影響;采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)TT細(xì)胞裸鼠移植瘤中周期素E(Cyclin E)、FGF-1、血小板/內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(CD31)蛋白的表達(dá)。結(jié)果:成功建立了TT-S100A13-GFP、TT-GFP及TT細(xì)胞裸鼠移植瘤模型。與TT-GFP及TT細(xì)胞組比較, TT-S100A13-GFP組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)速度明顯增快、體積明顯增大(第45天起有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.05)。TT-S100A13-GFP組裸鼠移植瘤瘤重大于TT-GFP

12、及TT組(P<0.05)。TT-S100A13-GFP組裸鼠移植瘤中Cyclin E、FGF-1、CD31蛋白表達(dá)明顯強(qiáng)于TT-GFP及TT組(P<0.05)。結(jié)論:S100A13的高表達(dá)能促進(jìn)TT細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng);移植瘤中S100A13的高表達(dá)能增強(qiáng)Cyclin E、FGF-1、CD31蛋白的表達(dá)。
　　第四部分，shRNA干擾S100A13基因?qū)T細(xì)胞釋放FGF-1的影響
　　目的:探討S100A13沉默對(duì)無血清處理

13、TT細(xì)胞FGF-1釋放的影響。方法:將S100A13-shRNA pENTRTM/U6入門質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TT細(xì)胞,應(yīng)用Real TimePCR、間接免疫熒光法及Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)S100A13基因及蛋白表達(dá)的抑制效率,應(yīng)用間接免疫熒光及ELISA檢測(cè)無血清處理TT細(xì)胞S100A13沉默后FGF-1釋放變化。結(jié)果:S100A13-shRNA pENTRTM/U6入門載體轉(zhuǎn)染TT細(xì)胞后能夠抑制S100A13基因及蛋白表達(dá),抑制

14、效率約為80%。間接免疫熒光法顯示FGF-1主要位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核,無血清培養(yǎng)6h胞漿內(nèi)FGF-1基本消失。ELISA結(jié)果顯示,S100A13沉默能降低無血清處理 TT細(xì)胞培養(yǎng)上清中 FGF-1的濃度(P<0.05)。結(jié)論: S100A13-shRNA pENTRTM/U6入門載體能有效、特異性地抑制S100A13基因及蛋白表達(dá);S100A13基因的沉默可以抑制FGF-1從細(xì)胞內(nèi)釋放到細(xì)胞外。
　　第五部分，Ca2+螯合劑對(duì)無血清

15、處理TT細(xì)胞內(nèi)S100A13和FGF-1釋放的影響
　　目的:探討Ca2+螯合劑對(duì)無血清處理TT細(xì)胞內(nèi)S100A13、FGF-1蛋白釋放的影響,初步闡明Ca2+在S100A13、FGF-1蛋白釋放過程中的作用。方法:應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)、外Ca2+螯合劑BAPTA-AM(2.5μmol/L)、EGTA(2.5mmol/L)對(duì)無血清處理TT細(xì)胞1h[Ca2+]i的變化,采用Western Blot檢測(cè)無血清處理0h

16、、1h、2h、4h、6h細(xì)胞S100A13、FGF-1蛋白表達(dá)量,間接免疫熒光觀察BAPTA-AM、EGTA對(duì)無血清處理6h細(xì)胞S100A13、FGF-1蛋白熒光分布的影響,Western Blot檢測(cè)S100A13、FGF-1蛋白表達(dá)量, ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清FGF-1蛋白濃度。結(jié)果:激光共聚焦Ca2+熒光顯像結(jié)果顯示:正常培養(yǎng)的TT細(xì)胞[Ca2+]i約0.1~0.3μmol/L,在掃描期間較穩(wěn)定;無血清處理TT細(xì)胞[Ca2+]i在

17、23分鐘內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定,第23分鐘后TT細(xì)胞[Ca2+]i迅速上升出現(xiàn)Ca2+波峰,達(dá)1.6μmol/L,第40分鐘TT細(xì)胞[Ca2+]i下降,40分鐘至60分鐘[Ca2+]i約為0.3μmol/L—0.6μmol/L,1h內(nèi)TT細(xì)胞平均[Ca2+]i明顯高于正常培養(yǎng)組(P<0.05)。EGTA、BAPTA-AM能明顯抑制無血清處理引起的TT細(xì)胞[Ca2+]i升高,平均[Ca2+]i與正常培養(yǎng)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Wester

18、n Blot結(jié)果顯示無血清處理TT細(xì)胞S100A13、FGF-1蛋白表達(dá)量4h組、6h組均降低,0h、1h、2h三組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,4h組TT細(xì)胞S100A13、FGF-1蛋白表達(dá)與0h、1h、2h組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),6h組TT細(xì)胞S100A13、FGF-1蛋白表達(dá)與0h、1h、2h、4h組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。間接免疫熒光結(jié)果顯示無血清處理6h TT細(xì)胞內(nèi)S100A13、FGF-1蛋白熒光強(qiáng)度較正常培養(yǎng)

19、組明顯減弱;EGTA、BAPTA-AM能拮抗無血清處理TT細(xì)胞內(nèi)S100A13、FGF-1蛋白熒光變?nèi)?。Western Blot結(jié)果顯示無血清處理6h TT細(xì)胞S100A13、FGF-1蛋白表達(dá)量較正常培養(yǎng)組明顯降低,加入Ca2+螯合劑EGTA、BAPTA-AM時(shí)TT細(xì)胞S100A13、FGF-1蛋白表達(dá)量與正常培養(yǎng)組無明顯差異;上述各組細(xì)胞培養(yǎng)上清ELISA結(jié)果顯示,無血清處理6h組TT細(xì)胞培養(yǎng)上清中FGF-1濃度較其它4組明顯升高(