甲基乙二醛、晚期糖基化產(chǎn)物對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞生物學(xué)作用的體外研究.pdf

1、目的：1．研究葡萄糖降解產(chǎn)物甲基乙二醛(MGO)、晚期糖基化產(chǎn)物(AGE-HSA)對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞(HPMC)分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、單核細(xì)胞趨化因子．1(MCP-1)的影響，參與的信號(hào)傳導(dǎo)通路及Simvastatin的干預(yù)作用。探討MGO和AGE-HSA對(duì)腹膜血管生成的影響及Simvastatin的干預(yù)作用。2．研究MGO和AGE-HSA對(duì)HPMC細(xì)胞毒性、細(xì)胞增殖的影響及參與信號(hào)傳導(dǎo)通路。探討MGO和AGE-HSA對(duì)腹

2、膜間皮細(xì)胞的損傷的影響3．研究AGE-HSA對(duì)HPMC合成細(xì)胞外基質(zhì)的作用及參與信號(hào)傳導(dǎo)通路。探討AGE-HSA對(duì)腹膜纖維化的影響。 方法：分別用不同濃度的MGO、AGE-HSA、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制劑、抗氧化劑(NAC)及Simvastatin作用于HPMC。L采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(EUSA)檢測(cè)HPMC的VEGF、MCP-1、纖維連接蛋白(FN)的基因和蛋白的表達(dá)。2．采用流式細(xì)胞

3、術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平。3．采用免疫印跡(Westernblot)檢測(cè)MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活。4．采用相差顯微鏡下觀察HPMC細(xì)胞形態(tài)的改變。5．采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。6．采用3H-胸腺嘧啶核苷滲入法檢測(cè)細(xì)胞增殖。 結(jié)果：LMGO和AGE-HSA以時(shí)間和濃度依賴的方式刺激HPMC的VEGFmRNA和蛋白的表達(dá)，二者有協(xié)同作用。2．AGE-HSA以時(shí)間和濃度依賴的方式刺激HPMC的MCP-1mRNA和蛋白的表達(dá)，

4、MGO對(duì)HPMC的MCP-1mRNA的表達(dá)則沒(méi)有明顯的影響。3．MGO在刺激HPMC表達(dá)VEGF的同時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生、同時(shí)以時(shí)間依賴方式促進(jìn)P-38MAPK磷酸化。抗氧化劑NAC抑制細(xì)胞內(nèi)ROS后，P-38MAPK磷酸化減少，同時(shí)VEGF表達(dá)也減少。P-38MAPK特異性阻斷劑SB203580阻斷P-38MAPK磷酸化后，VEGF表達(dá)也減少。4．AGE-HSA在刺激HPMC表達(dá)VEGF、MCP-1的同時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生

5、、同時(shí)以時(shí)間依賴方式促進(jìn)P-42／44MAPK、P-38MAPK磷酸化，用抗氧化劑NAC抑制細(xì)胞內(nèi)ROS后，P-42／44MAPK、P-38MAPK磷酸化減少，同時(shí)VEGF和MCP-1表達(dá)也減少。MEK特異抑制劑PD98059抑制P-42／44MAPK磷酸化后、或者P-38MAPK特異性阻斷劑SB203580抑制P-38MAPK磷酸化后，VEGF和MCP-1表達(dá)也減少了。AGE-HSA不激活JNK信號(hào)通路。5．Simvastatin能夠

6、以劑量依賴的方式抑制AGE-HSA誘導(dǎo)的MCP-1表達(dá)，F(xiàn)PP和GGPP能夠逆轉(zhuǎn)Simvastatin的作用，而Simvastatin對(duì)VEGF表達(dá)則沒(méi)有明顯的作用。6．高濃度的MGO(160～320μM)以濃度依賴的方式使細(xì)胞活力下降，形態(tài)發(fā)生改變和抑制細(xì)胞增殖，而低濃度的MGO(O～80μM)以及AGE-HSA對(duì)細(xì)胞活力、形態(tài)和細(xì)胞增殖沒(méi)有明顯的影響。7．AGE-HSA以時(shí)間和濃度依賴的方式刺激HPMC合成FN。8.PKC激動(dòng)劑佛波

7、酯PMA也能刺激HPMC合成FN，先用PMA耗竭細(xì)胞內(nèi)PKC或加用PKC抑制劑CalphostinC后，可以抑制AGE-HSA誘導(dǎo)的FN分泌。 結(jié)論：1．MGO和AGE-HSA部分通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS、激活P-42／44MAPK、P-38MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)VEGF、MCP-1表達(dá)，參與腹膜血管生成。二者有協(xié)同作用。2．高濃度的MGO具有明顯細(xì)胞毒性和抑制細(xì)胞增殖作用，參與長(zhǎng)期腹透腹膜間皮細(xì)胞的損傷。3．AGE-HSA部分通過(guò)